REFERATE GENERALE

Metode de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate ca standarde de referinţă

 Laboratory Methods for the Physico-Chemical Characterization of Recombinant Allergens as Reference Standards

First published: 31 martie 2020

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Aler.4.1.2020.2978

Abstract

The methods used to quantify the physico-chemical parameters of molecular allergens are multiple. The physico-chemical parameters selected for the evaluation of the quality of natural purified and recombinant allergens include the identity of the primary structure, the secondary structure, the purity and homogeneity. However, there is no single method that can analyze all the important characteristics represented by structural, physico-chemical and immunological properties.
 

Keywords
molecular allergens, physico-chemical characteristics, laboratory methods

Rezumat

Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizico-chimici ai alergenelor moleculare sunt multiple. Parametrii fizico-chimici selectaţi pentru evaluarea calităţii alergenelor naturale purificate şi recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea şi omogenitatea. Nu există însă o unică metodă care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăţi structurale, fizico-chimice şi imunologice.

 

Caracterizarea riguroasă prin metode chimice, fizico-chimice şi biologice a produselor bioterapeutice produse prin tehnologia ADN‑ului recombinat este esenţială, conform recomandărilor Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii (World Health Organization, WHO). Metodele proteomice, biochimice şi imunochimice de caracterizare a alergenelor recombinate efectuate în faza de dezvoltare determină proprietăţile fizico-chimice, imunochimice, activitatea biologică, puritatea şi confirmă calitatea produselor alergenice. Stabilirea unor standarde de referinţă bine caracterizate bazate pe alergene recombinate şi metode de analiză de laborator validate pentru cuantificarea alergenelor moleculare sunt obiective semnificative ale Programului de standardizare biologică al Direcţiei Europene pentru Calitatea Medicamentelor şi a Sănătăţii (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM)(1-5).

Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizico-chimici ai produselor alergenice sunt multiple(6-9). Conform unui proiect important finanţat de Uniunea Europeană, denumit CREATE (Development of Certified Reference Materials for Allergenic Products and Validation of Methods for their Quantification), parametrii fizico-chimici selectaţi pentru evaluarea calităţii alergenelor naturale purificate şi recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea şi omogenitatea, iar metodele de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate, inclusiv ca standarde de referinţă (pentru Bet v 1.0101 şi Phl p 5.0109), au fost publicate detaliat şi le vom menţiona în continuare(3-5,10-12). Nu există însă o metodă unică care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăţi structurale, fizico-chimice şi imunologice (13,14).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza identitatea, cantitatea şi structura

Alergenele trebuie să prezinte compoziţie şi secvenţe de aminoacizi în acord cu secvenţele primare cunoscute (publicate). Investigarea identităţii proteice pentru alergenele moleculare recombinate se face prin metode bazate pe spectrometrie de masă şi analiza aminoacizilor. Analiza greutăţii moleculare intacte a unei proteine se face prin spectrometrie de masă (mass spectrometry, MS). Spectrometria de masă de înaltă rezoluţie (high-resolu­tion mass spectrometry, HRMS) este utilizată pentru măsurarea intactă a masei pe diferite platforme care utilizează tehnica cuadrupolului, a trapei orbitale şi a trapei ionice. Secvenţierea peptidelor (peptide mapping) produse prin digestia enzimatică proteolitică se realizează prin cromatografie nanolichidă cu detecţie prin spectrometrie de masă în tandem (nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, NanoLC-MS/MS) ca tehnică principală pentru confirmarea structurii primare proteice (secvenţa de aminoacizi).

Evaluarea cantitativă proteică este cuantificată prin analiza aminoacizilor (amino acid analysis, AAA). Trebuie să existe o corelaţie excelentă între compoziţia (identitatea) teoretică a aminoacizilor şi cea observată experimental. Metodele de analiză a aminoacizilor includ hidroliza convenţională şi derivatizare pre-coloană cu fenilizotiocianat (PITC) şi separare prin cromatografie lichidă de înaltă performanţă (HPLC) sau cu o-ftalaldehidă (OPA) şi HPLC în fază inversă (RP-HPLC).

Spectroscopia de dicroism circular (circular dichroism, CD) este frecvent utilizată pentru a analiza structura secundară (regiunea spectrală UV îndepărtată). Spectrometrele dedicate măsurării fenomenului de dicroism circular sunt denumite spectropolarimetre. Alergenele recombinate trebuie să aibă structura proteică pliată corespunzător. Dicroismul circular al moleculelor candidate trebuie să prezinte caracteristici spectrale tipice unei proteine pliate cu amplitudini de vârf similare spectrelor de referinţă. Această metodă nu numai că furnizează informaţii pur structurale despre alergene, dar poate permite predicţii despre activitatea alergenică.

Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) poate furniza de asemenea informaţii utile, deoarece proteinele denaturate pot prezenta alterarea funcţiei de distribuţie a distanţei pentru perechi (pair distance distribution function, PDDF).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza omogenitatea

Alergenele recombinate trebuie să fie omogene în ceea ce priveşte greutatea moleculară şi să fie comparabile cu omologii lor naturali. Electroforeza în gel de poliacrilamidă cu dodecilsulfat de sodiu (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) sau electroforeza cu focalizare izoelectrică (isoelectric focusing, IEF), cu colorare cu albastru briliant de Coomassie (Coomassie staining), acid periodic Schiff (PAS) sau nitrat de argint (silver staining) separă alergenele moleculare recombinate în cantităţi de ordinul microgramelor, iar identitatea benzilor vizibile de proteine ​​poate fi relevată prin metoda imunoblotting cu utilizarea de anticorpi monoclonali specifici alergenelor recombinate şi eşantion de seruri de la pacienţi alergici. Modificările posttranslaţionale, de agregare sau degradare, pot produce benzi suplimentare.

Metoda care este folosită în mod obişnuit pentru a evalua omogenitatea este cromatografia de filtrare în gel. Pentru proteinele monomerice, eşantionul trebuie să conţină un vârf (peak) unic de greutate moleculară preconizată. Cromatografia lichidă de înaltă performanţă (high-performance liquid chromatography, HPLC) de tip gel-filtrare sau cromatografia de excluziune sterică (size-exclusion chromatography, SEC) este utilizată pentru a evalua omogenitatea în soluţie, putând fi detectate forme oligomerice sau monomerice, agregate şi produse de degradare. Cromatograma de excludere moleculară monitorizată prin semnal de dispersie a luminii în unghi drept (right-angle light scattering, RALS) este extrem de sensibilă pentru agregatele cu greutate moleculară mare. Greutatea moleculară (kDa) şi raza hidrodinamică (nm) pot fi determinate prin combinarea RALS cu indicele de refracţie şi semnalul de viscozitate. Este posibil să se determine dacă alergenul recombinat constă din > 99,9% molecule monomerice omogene.

Microscopia electronică cu tehnică de colorare negativă (negative staining) poate fi utilizată pentru evidenţierea prezenţei agregatelor de dimensiuni diferite. Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) oferă informaţii despre statusul agregării moleculelor proteice în soluţie. Modificările posttranslaţionale şi chimice rezultate din procesul de producţie prin tehnica de recombinare pot fi detectate şi cuantificate prin spectrometria de masă pentru eterogenitate.

Comportamentul de agregare şi stabilitatea în soluţie sunt investigate prin metoda de dispersie dinamică a luminii (dynamic light scattering, DLS), care evaluează agregatele cu greutate moleculară mai mare şi polidispersitatea. În plus, poate detecta modificări ale razei hidrodinamice după mai multe săptămâni de depozitare.

În studiile de stabilitate conformaţională a fost adăugată şi spectroscopia în infraroşu cu transformată Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza puritatea

Preparatele alergenice trebuie să fie cel puţin 95% pure din punctul de vedere al conţinutului proteic. Metoda de elecţie pentru puritate este SDS-PAGE în combinaţie cu colorarea cu argint. Prin SDS-PAGE pot fi detectate proteinele contaminante cu greutate moleculară diferită. Analiza aminoacizilor oferă informaţii suplimentare despre puritate, deoarece contaminarea cu alte proteine poate modifica conţinutul de aminoacizi individuali. Mai mult, la utilizarea MS sau SEC-HPLC, contaminarea cu proteine cu greutate moleculară diferită poate duce la vârfuri (peaks) suplimentare. Trebuie menţionat şi faptul că SEC-HPLC şi alte metode cromatografice, precum cromatografia de imunoafinitate şi cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizaţi (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC), sunt utilizate ca metode de purificare a alergenelor recombinate.

În afara metodelor precizate anterior pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate, merită menţionate şi metodele de caracterizare ­imunologică(3-5,8,14). Metodele de caracterizare in vitro a activităţii biologice sunt reprezentate de testele de inhibare a legării IgE (IgE-binding inhibition), de tip inhibiţia RAST (radioallergosorbent test inhibition), inhibiţia ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) şi inhibiţia ImmunoCAP FEIA (fluorescence enzyme immunoassay). Alte metode in vitro de cuantificare a reactivităţii imune sunt reactivitatea IgE prin analiză imunoblot de tip dot-blot şi testul de eliberare a histaminei din bazofile cu IgE înlăturate de pe suprafaţă cu acid lactic (stripped basophil histamine release assay). Integritatea şi echivalenţa epitopilor recombinaţi cu componentele alergenice moleculare naturale purificate pot fi determinate prin testul de activare a bazofilelor (basophil activation test, BAT) cu cuantificarea expresiei markerului de suprafaţă CD203c şi evaluarea reactivităţii limfocitelor T alergen-specifice prin teste de proliferare limfocitară cu încorporare de timidină tritiată şi rezultate exprimate ca index de stimulare.

În final, subliniem importanţa datelor EDQM referitoare la caracterizarea şi cuantificarea alergenelor recombinate şi adoptarea de către Farmacopeea Europeană a metodelor şi materialelor de referinţă pentru cuantificarea alergenelor(2-5,14,15). De exemplu, rBet v 1.0101 şi rPhl p 5.0109, produse în condiţii de bună practică de fabricaţie (good manufacturing practice, GMP), sunt extrem de asemănătoare cu omologii lor naturali din punct de vedere fizico-chimic, structural şi biologic, de aceea sunt considerate adecvate ca standarde de referinţă pentru Farmacopeea Europeană(4,5). În afara stabilirii standardelor de referinţă prezentate, recent este discutată necesitatea validării metodelor ELISA de tip sandwich pentru cuantificarea alergenelor moleculare majore ca metodologie standard pentru Farmacopeea Europeană(16).

Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenţia, diagnosticul şi terapia afecţiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozia), cod SMIS 103662.

Bibliografie

  1. World Health Organization. WHO Expert Committee on Biological Standardization. World Health Organ Tech Rep Ser. 2014; (987):1-266
  2. The European Parliament and Council. Directive 2001/83/EC on the community code relating to medicinal products for human use. Official Journal of the European Communities. 2001; L331: 67-128.
  3. van Ree R, Chapman MD, Ferreira F, Vieths S, Bryan D, Cromwell O, Villalba M, Durham SR, Becker WM, Aalbers M, André C, Barber D, Cistero Bahima A, Custovic A, Didierlaurent A, Dolman C, Dorpema JW, Di Felice G, Eberhardt F, Fernandez Caldas E, Fernandez Rivas M, Fiebig H, Focke M, Fötisch K, Gadermaier G, Das RG, Gonzalez Mancebo E, Himly M, Kinaciyan T, Knulst AC, Kroon AM, Lepp U, Marco FM, Mari A, Moingeon P, Monsalve R, Neubauer A, Notten S, Ooievaar-de Heer P, Pauli G, Pini C, Purohit A, Quiralte J, Rak S, Raulf-Heimsoth M, San Miguel Moncin MM, Simpson B, Tsay A, Vailes L, Wallner M, Weber B. The CREATE project: development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification. Allergy. 2008; 63(3): 310-326.
  4. Himly M, Nony E, Chabre H, Van Overtvelt L, Neubauer A, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Moingeon P, Ferreira F. Standardization of allergen products: 1. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Bet v 1.0101 as biological reference preparation. Allergy. 2009; 64(7): 1038-45.
  5. Himly M, Nandy A, Kahlert H, Thilker M, Steiner M, Briza P, Neubauer A, Klysner S, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Ferreira F. Standardization of allergen products: 2. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Phl p 5.0109 as European Pharmacopoeia reference standard. Allergy. 2016; 71(4): 495-504.
  6. WHO Position Paper. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. Geneva: January 27-29 1997. Allergy. 1998; 53(44 Suppl): 1-42.
  7. Becker WM, Vogel L, Vieths S. Standardization of allergen extracts for immunotherapy. Where do we stand? Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2006; 6(6): 470-475.
  8. Popescu FD, Vieru M, Popescu F. Standardizarea preparatelor alergenice pentru imunoterapia sublinguală în alergia la polen de graminee. Journal of Romanian Society of Allergology and Clinical Immunology. 2014; 11(3): 86-91.
  9. Schmidt H, Gelhaus C, Nebendahl M, Janssen O, Petersen A. Characterization of Phleum pratense pollen extracts by 2-D DIGE and allergen immunoreactivity. Proteomics. 2010; 10(24): 4352-4362.
  10. Asam C, Roulias A, Parigiani MA, Haab A, Wallner M, Wolf M, Briza P, Bohle B, Ferreira F, Hauser M. Harmonization of the genetic code effectively enhances the recombinant production of the major birch pollen allergen Bet v 1. Int Arch Allergy Immunol. 2018; 177(2): 116-122.
  11. Najafi N, Hofer G, Gattinger P, Smiljkovic D, Blatt K, Selb R, Stoecklinger A, Keller W, Valent P, Niederberger V, Thalhamer J, Valenta R, Flicker S. Fusion proteins consisting of Bet v 1 and Phl p 5 form IgE-reactive aggregates with reduced allergenic activity. Sci Rep. 2019; 9(1):4006.
  12. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergens: from production and characterization to diagnosis, treatment, and prevention of allergy. Methods. 2004; 32(3): 207-8.
  13. Valenta R, Karaulov A, Niederberger V, Zhernov Y, Elisyutina O, Campana R, Focke-Tejkl M, Curin M, Namazova-Baranova L, Wang JY, Pawankar R, Khaitov M. Allergen extracts for in vivo diagnosis and treatment of allergy: is there a future? J Allergy Clin Immunol Pract. 2018; 6(6): 1845-1855.
  14. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Costanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias JA, Barber D, Carnés J, Chapman M, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Hanschmann KM, Holzhauser T, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Reese G, Sandberg E, Sander I, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Vieths S. Standardization of allergen products: 3. Validation of candidate European Pharmacopoeia standard methods for quantification of major birch allergen Bet v 1. Allergy. 2016; 71(10): 1414-24.
  15. Bonini S. Regulatory aspects of allergen-specific immunotherapy: Europe sets the scene for a global approach. World Allergy Organ J. 2012; 5(10): 120-123.
  16. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Constanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias J, Arilla MC, Barber D, Bertocchi A, Brunetto B, Carnes JA, Chapman M, Chaudemanche G, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Gallego MT, Iacovacci P, Hanschmann KM, Holzhauser T, Hrabina M, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Raulf M, Reese G, Sandberg E, Sander I, Smith B, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Weber B, Vieths S. Validation of ELISA methods for quantification of the major birch allergen Bet v 1 (BSP090). Pharmeur Bio Sci Notes. 2017; 2017: 69-87.