Evaluarea reacţiilor alergice la medicamente utilizând metode in vitro bazate pe celule (RBL vs. BAT)

Alergiile medicamentoase au un fond imunologic şi pot fi clasificate, conform lui Gell şi Coombs, în patru tipuri de reacţii: tipul I – reacţii de hipersensibilitate mediate de anticorpi IgE, manifestările clinice tipice fiind urticaria şi anafilaxia; tipul II – reacţii citotoxice mediate de anticorpi IgG sau IgM specifici; tipul III – reacţii mediate de complexe imune formate de complement şi anticorpi IgG sau IgM specifici medicamentului, simptomele tipice fiind anemia hemolitică şi boala serului; tipul IV – reacţii de hipersensibilitate mediate de celulele T⁽¹⁾. Cele mai frecvente reacţii alergice la medicamente sunt cele mediate de IgE şi cele mediate de celulele T. Există, de asemenea, un tip de clasificare bazat pe intervalul de timp dintre momentul administrării medicamentului şi apariţia simptomelor clinice⁽²⁾. Reacţiile care apar în decurs de o oră sau mai puţin sunt considerate reacţii accelerate, iar cele care apar între 1 şi 6 ore de la administrarea medicamentului sunt considerate reacţii întârziate⁽³⁾.

Reacţiile de hipersensibilitate la medicamente reprezintă 15% din toate reacţiile adverse la medicamente, provocând probleme serioase de sănătate⁽⁴⁾. Diagnosticul reacţiilor de tip I la medicamente se bazează pe o anamneză completă: istoric clinic, cauze posibile şi durată. Până în prezent, standardul de aur pentru determinarea sau excluderea unei alergii medicamentoase a fost testul de provocare la medicament, dar, din cauza problemelor sale etice şi practice, nu este potrivit pentru practica clinică de rutină⁽⁵⁾. Prin urmare, în cazul reacţiilor imediate la medicamente, medicii se bazează pe determinarea in vivo a reacţiilor IgE-mediate (teste cutanate) şi pe cuantificarea anticorpilor IgE specifici. Întrucât testarea in vivo implică riscul de apariţie a unei noi reacţii alergice, teste de diagnostic in vitro sunt absolut necesare. Astfel, au fost dezvoltate noi metode de diagnosticare a alergiilor la medicamente, cum ar fi testul de activare a bazofilelor (Basophil Activation Test; BAT). Acest articol rezumă literatura de specialitate privitoare la utilizarea testului de activare a bazofilelor în domeniul alergiei la medicamente, concentrându-se asupra performanţelor şi a limitărilor sale de diagnosticare, şi prezintă, de asemenea, potenţialele aplicaţii ale unor linii celulare, precum celulele leucemice bazofilice de şobolan (RBL – rat basophilic leukemia), pentru evaluarea reacţiilor de hipersensibilitate la medicamente.

Evaluarea hipersensibilităţii imediate la medicamente utilizând testul de activare a bazofilelor

Caracteristica principală a celulelor implicate în alergia de tip imediat este capacitatea de legare a IgE specific de receptorul IgE de înaltă afinitate (FcεRI) de pe suprafaţa celulară. Legarea alergenilor la IgE de la suprafaţă are ca rezultat încrucişarea FcεRI, provocând faza acută a răspunsului alergic, care determină eliberarea bruscă a mediatorilor vasoactivi în ţesut şi/sau în circulaţie. Acest proces se numeşte degranulare anafilactică (şi poate induce o reacţie anafilactică extrem de gravă)⁽⁶⁾. În schimb, în ​​degranularea fragmentară, celulele secretă conţinutul de granule fără exocitoză⁽⁷⁾. Mastocitele şi bazofilele prezintă aceleaşi caracteristici-cheie. Celulele mastocitare se găsesc în ţesut şi sunt considerate celule alergice primare⁽⁸⁾. Bazofilele sunt granulocite din sângele periferic, având granule secretoare care conţin histamină. De asemenea, sunt capabile să secrete proteaze, citokine, chemokine şi mediatori lipidici. Bazofilele prezintă pe suprafaţă markeri unici în funcţie de tipul de degranulare prin care trec aceste celule – anafilactică sau fragmentară – şi care pot fi apoi măsuraţi prin citometrie în flux⁽⁹⁾.

Activarea bazofilelor este un proces care începe cu modificări intracelulare (transducţia semnalului de la FcεRI prin intermediul fosforilării p38MAPK şi a influxului de calciu), urmată de modificări la nivelul membranei celulare (CD203c), cu degranularea finală a bazofilelor (CD63)⁽¹⁰⁾. Testul de activare a bazofilelor măsoară o activare in vitro a bazofilelor pacienţilor. După prepararea probelor de sânge (analiza sângelui integral sau a leucocitelor izolate) şi preincubarea cu interleukină IL-3 (în funcţie de alergenul de interes) sau preîncălzirea probelor de sânge şi a reactivilor la 37 °C, se adaugă alergenul, iar bazofilele sunt incubate 15 minute până la o oră, la 37 °C, în baia de apă (din nou, în funcţie de alergenul de interes). Ulterior, acestea sunt colorate cu ­anticorpi monoclonali cuplaţi cu fluorocromi (figura 1). O altă etapă este liza eritrocitelor contaminante. Pentru o cuantificare exactă a activării bazofilice, numărul minim de bazofile care urmează să fie analizate ar trebui să fie de 200 per tub de testare, dar, pentru a minimiza variaţia rezultatelor cauzate de eroarea de măsurare a echipamentului, este de preferat să se evalueze 600 până la 1000 de bazofile. Pentru a selecta bazofilele din întreaga populaţie de leucocite, sunt posibile mai multe strategii de selecţie pozitivă şi negativă (de exemplu, anti-CDR3/anti-CD3, anti-CD123/anti-HLA-DR)⁽¹¹⁾.
 

CD63 este o proteină cu o greutate moleculară de 53 kDa, care face parte din superfamilia proteinelor transmembranare-4, fiind cunoscută şi ca glicoproteina-3 membranară asociată lizozomului (LAMP-3). La bazofilele inactive, această proteină este localizată pe membrana granulelor secretoare intracelulare. După stimularea cu FcRI, aceste granule fuzionează cu membrana plasmatică şi, astfel, CD63 se exprimă pe suprafaţa bazofilelor degranulate (Knol et al., 1991). Studiile anterioare au arătat că acest marker este asociat cu granulele care conţin histamină, sugerând că fenomenul de up-regulation al CD63 poate fi utilizat ca marker indirect al eliberării histaminei^(13,14). Cu toate acestea, studii recente sugerează că eliberarea histaminei poate fi o sumă atât a degranulării anafilactice, cât şi a degranulării fragmentare, iar fenomenul de up-regulation al CD63 poate fi reprezentativ doar pentru degranularea anafilactică⁽¹⁵⁾.

CD203c este un alt marker de activare a bazofilelor, prezent pe celule progenitoare CD34+, bazofile şi mastocite. Este o moleculă transmembranară glicozilată de tipul II, care aparţine familiei de enzime pirofosfataze/fosfodiesteraze ectonucleotidice⁽¹⁶⁾. CD203c este exprimat constitutiv în cantităţi scăzute pe suprafaţa membranei bazofilelor şi suferă un proces rapid de up-regulation după activarea celulei de către alergen (figura 2) sau mai lent prin IL-3⁽¹⁷⁾. Acest tip de ­up-regulation diferă de cel de la CD63 în ceea ce priveşte stimulii declanşatori şi evenimentele de semnalizare timpurie, ceea ce sugerează că CD203c poate fi asociat cu degranularea fragmentară⁽⁹⁾.
 

În contextul unei reacţii alergice la medicamente sau la compuşi înrudiţi, există mai multe studii care validează testul de activare a bazofilelor pentru diagnosticarea unei alergii mediate de IgE. Este cazul unor agenţi blocanţi neuromusculari (NMBA)⁽¹⁸⁾, antibiotice beta-lactamice şi acidul clavulanic ca inhibitor de beta-lactamază^(19-21), medii de contrast iodat⁽²²⁾.

În cazul medicamentelor cu greutate moleculară mică, numite haptene, care nu sunt capabile să determine singure încrucişarea FcεRI (conceptul haptenei⁽²³⁾), este necesară o conjugare cu molecule carrier (figura 3). Moleculele carrier sunt, de obicei, proteine care provoacă o reacţie imună la persoanele sensibile. Mai mult decât atât, după metabolizarea medicamentului se pot forma intermediari reactivi (conceptul pro-haptenei^(24,25)). De aceea, pentru investigarea reacţiilor de hipersensibilitate la medicamente a fost promovată utilizarea metaboliţilor medicamentoşi şi a conjugatelor haptenă-carrier^(26,27). De exemplu, în cazul hipersensibilităţii la propifenazonă (PP), bazofilele au reacţionat la testul de activare numai după stimularea cu conjugatul medicament-carrier, nu când au fost stimulate cu propifenazonă pură⁽²⁸⁾. Cu toate acestea, ca o consecinţă a lipsei de cunoştinţe cu privire la determinanţii relevanţi, intermediarii metabolici şi funcţiile lor reactive, lungimea de legare necesară la molecula carrier şi orientarea haptenei, testul de activare a bazofilelor este cel mai frecvent efectuat cu soluţii de medicamente pure⁽²⁸⁾.
 

Testul de activare a bazofilelor prezintă şi câteva limitări, enumerate în tabelul 1, alături de posibilele soluţii. Una dintre aceste limitări este stabilitatea probelor de sânge. Utilizarea EDTA ca anticoagulant înseamnă că eşantionul este stabil doar câteva ore, aşa că a fost dezvoltată o nouă metodă – sensibilizarea pasivă. Principalii paşi ai sensibilizării pasive sunt: izolarea celulelor mononucleare din sângele periferic (PBMC) de la un donator sănătos, cu bazofilele bine caracterizate; îndepărtarea IgE de pe receptori cu acid lactic (pH 3,9), incubarea cu serul pacientului (o oră, 37 °C), urmată de un test de activare a bazofilelor obişnuit, aşa cum a fost descris anterior. Astfel, probele pacientului sunt reprezentate de ser, care poate fi stocat o perioadă mai îndelungată la 4°C⁽¹¹⁾.
 

Evaluarea hipersensibilităţii imediate la medicamente folosind metode bazate pe linii celulare

Cercetarea pentru o mai bună înţelegere a proceselor imunologice este adesea dificilă, din cauza anumitor factori care complică izolarea şi cultura primară a celulelor care se pot degranula, precum mastocitele şi bazofilele⁽²⁹⁾. Mastocitele obţinute din progenitori din sângele periferic au dezavantajul unor protocoale lungi de cultivare şi diferenţiere⁽³⁰⁾. Pe de altă parte, celulele mastocitare peritoneale pot fi obţinute cu uşurinţă prin lavajul peritoneal al animalelor mici. Dar, după izolare, aceste celule trebuie purificate. Purificarea poate afecta răspunsul lor la stimuli⁽³¹⁾. În plus, nu este posibilă menţinerea unei culturi primare pe perioade lungi. Prin urmare, utilizarea liniilor celulare continue reprezintă o soluţie fezabilă (tabelul 2).
 

Linia celulară RBL-2H3 (Rat Basophilic Leukemia) este utilizată, în mod obişnuit, pentru evidenţierea eliberării de histamină în investigaţiile imunologice, alergice şi inflamatorii. Această linie celulară a fost clonată din celule leucemice izolate de la şobolani după tratamentul cu o substanţă chimică carcinogenă, β-cloretilamină⁽³³⁾. Celulele RBL-2H3 au fost utilizate adesea pentru studierea interacţiunilor IgE-FcεRI⁽³⁴⁾. Linia celulară RBL-2H3 este un model consacrat pentru studiul mecanismului secretor de eliberare a histaminei, datorită condiţiilor relativ simple necesare pentru a le menţine în cultură, precum şi vitezei de creştere spre o populaţie confluentă⁽³⁵⁾. Aceste celule exprimă toate subunităţile receptorului de afinitate mare pentru IgE, dar IgE uman poate lega numai receptorii IgE de la primate, prin urmare, celulele RBL au fost transfectate cu secvenţa ADNc care codifică domeniul de legare a ligandului receptorului IgE uman, FcεRI⁽³⁶⁾, astfel încât aceştia pot lega IgE din serul uman şi pot fi utilizaţi ca o metodă alternativă de diagnosticare a reacţiilor de hipersensibilitate.

Celulele sunt cultivate în DMEM suplimentat cu FBS 10% şi antibiotice (100 U/ml penicilină şi 100 µg/mL streptomicină) la 37 °C, în atmosferă umedă şi 5% CO₂, păstrându-se densitatea optimă a celulelor. După ataşarea IgE din serul pacientului, apare degranularea, din granulele specifice celulelor fiind eliberaţi doi mediatori: β-hexosaminidaza şi histamina. De aceea, degranularea poate fi monitorizată prin măsurarea β-hexosaminidazei şi a histaminei eliberate. Este preferată determinarea β-hexosaminidazei, datorită detectării rapide a acesteia.

Deoarece celulele RBL-2H3 sunt celule tumorale, este evident că ele prezintă caracteristici aberante şi anomalii. În plus, condiţiile de cultură pot afecta fenotipul lor, ducând la tulpini diferite. Chiar şi în cadrul aceleiaşi tulpini, condiţiile experimentale pot avea un efect profund asupra funcţiei lor⁽²⁹⁾, de aceea datele obţinute cu această linie celulară trebuie interpretate cu mare grijă.

Concluzii

Testul de activare a bazofilelor reprezintă o metodă sigură de diagnostic, putând fi utilizat pentru a evalua reacţiile de hipersensibilitate mediate de IgE şi, eventual, pentru reacţiile mediate de bazofile sau mastocite (mediate non-IgE). Cu toate acestea, în momentul de faţă este folosit mai mult în cercetare, dar pentru a fi acceptat în rutina clinică sunt necesare studii clinice suplimentare. De asemenea, este nevoie de o selectare corectă a pacienţilor şi a grupurilor de control nonalergice, pentru a stabili pragurile pozitive specifice fiecărui medicament. Pe de altă parte, testul de activare a bazofilelor poate fi utilizat împreună cu sensibilizarea pasivă a bazofilelor provenite de la donatori, care sunt puse în contact cu serul pacienţilor, evitându-se astfel principala problemă a probelor de sânge integral – nevoia de a fi procesate imediat.

O altă metodă de a testa reacţiile de hipersensibilitate la medicamente presupune utilizarea liniilor celulare. Celulele RBL-2H3 prezintă avantajul incontestabil de a fi o linie celulară uşor de cultivat. Cu toate acestea, există laboratoare care au raportat rezultate contradictorii, de aceea datele obţinute cu această linie celulară trebuie interpretate atent.