SINTEZE

Enterotoxina stafilococică B – agent potenţial de bioagresiune

 Staphylococcal enterotoxin B – bioterrorism potential agent

Cristiana Cerasella Dragomirescu, Mircea Ioan Popa, Ileana Luminiţa Coldea

First published: 16 iulie 2016

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

Abstract

Staphylococcus aureus, one of the most important human pathogens, secretes an impressive number of virulence factors that may cause a range of community or nosocomial infections with varying severity as well as toxinoses. The main function of the toxins is to inhibit the host immune response against S. aureus, but each toxin exerts specific biological functions, responsible for particular manifestations. So far there have been identified over 20 staphylococcal enterotoxins that are part of the superantigens family. Staphylococcal enterotoxin B, the most intensively studied of these, is involved frequently in the production of food poisoning. Staphylococcal enterotoxin B is part of the group B of bioterrorism agents classified by CDC (Centers for Disease Control and Prevention), being easily to spread and difficult to diagnose/identify in the initial stages.

Keywords
Staphylococcus aureus, coagulase positive staphylococci, superantigens, bioterrorism

Rezumat

Staphylococcus aureus, unul dintre cei mai importanţi patogeni umani, secretă un număr impresionant de factori de virulenţă ce pot determina o gamă variată de infecţii comunitare sau nosocomiale cu severitate variabilă, precum și afecțiuni determinate de toxinele pe care le eliberează. Funcţia principală a toxinelor este de a inhiba răspunsul imun al gazdei faţă de S. aureus, dar fiecare toxină exercită și funcţii biologice specifice, responsabile de manifestări clinice particulare. Până în prezent au fost descrise peste 20 de enterotoxine stafilococice ce fac parte din familia superantigenelor. Enterotoxina stafilococică B, cel mai intens studiată dintre acestea, este implicată frecvent în producerea toxiinfecţiilor alimentare, iar conform clasificării CDC (Centers for Disease Control and Prevention), face parte din grupa B a agenţilor de bioterorism, fiind ușor de diseminat și dificil de diagnosticat/ identificat în stadiile iniţiale. 

Introducere

Staphylococcus aureus (S. aureus), microorganism condiţionat patogen, constituent al microbiotei normale la om și animale, poate determina infecţii cu severitate variabilă, comunitare sau nosocomiale: foliculite, furuncule, impetigo, abcese, infecţii ale plăgilor, endocardite, osteomielite, pneumonii, septicemii și afecțiuni determinate de toxinele pe care le eliberează - epidermoliza buloasă stafilococică, sindromul de șoc toxico-septic stafilococic și toxiinfecții alimentare stafilococice(1). Această varietate de manifestări clinice se explică prin numărul mare de factori de virulenţă pe care fiecare tulpină de S. aureus îi secretă(2). Cei mai mulţi factori de virulenţă aparţin secretomului (proteine secretate)(3), ce include adezine legate covalent (matrix surface components recognizing matrix molecules – MSCRMMs) sau necovalent la suprafaţa celulei (secretable expanded repertoire adhesive molecules – SERAM), proteine ce acţionează ca toxine și superantigene, și proteine ce funcţionează ca enzime responsabile de răspândirea infecţiei și evitarea răspunsului imun.

Proprietăţi fizice, chimice, structurale și biologice ale enterotoxinelor stafilococice

Între superantigene sunt incluse și enterotoxinele produse de stafilococi(4). Acestea pot să activeze în mod nespecific clone de limfocite T. Limfocitele activate vor elibera molecule cu implicare în procesul inflamator: IL2, TNFß și interferon.

Până în prezent, au fost descrise cel puțin 20 de enterotoxine stafilococice: enterotoxinele stafilococice „clasice“: SEA-SEE, frecvent implicate în etiologia toxiinfecţiilor alimentare, și enterotoxinele nou descrise: SEG-SEX, identificate la tulpini de S. aureus izolate din diverse produse patologice, cât și din alimente, ale căror funcţii nu sunt încă pe deplin înţelese. Toate exprimă activitate superantigenică. Unele dintre exotoxine au și activitate emetică, reprezentând un pericol pentru cetățenii consumatori.

Enterotoxinele sunt proteine stabile, hidrosolubile, solubile în soluţii saline, rezistente la factorii de mediu ce pot distruge S. aureus (ex.: tratament termic). Sunt stabile și față de acțiunea enzimelor proteolitice: pepsină, tripsină, renină și papaină(5), ca atare prezintă activitate la nivel digestiv(6).

Enterotoxinele stafilococice sunt secretate în timpul fazei de creștere logaritmică sau în perioada de tranziţie de la faza de creștere exponenţială la faza staţionară(7). Au mase moleculare între 19 și 29 kDa, cu structură și secvenţă a aminoacizilor asemănătoare între ele(2), bogate în aminoacizi bazici: lizină, acid aspartic, acid glutamic, tirozină(8).

Primele cercetări asupra structurii enterotoxinelor implicate în producerea toxiinfecțiilor alimentare datează din anii 1950, Bergdoll reușind purificarea enterotoxinei B în 1959. În 1995, Swaminathan et al.(9) au descris structura cristalografică a enterotoxinei stafilococice B. Enterotoxinele stafilococice au formă elipsoidală și includ două domenii inegale. Enterotoxinele pot să prezinte reziduuri de cisteină și de triptofan. Prin combinații chimice rezultă modificări structurale, de exemplu buclarea lanțului polipeptidic. Bucla este implicată în activitatea emetică, în asociere cu o regiune situată în apropierea ei(6). Regiunile Vb implicate în realizarea activării(10) sunt caracteristice fiecărui tip de enterotoxină(11, 12). Deși există anumite diferenţe în structura enterotoxinelor, există și similarităţi(13).

Enterotoxina stafilococică B - agent potenţial de bioagresiune

Enterotoxina stafilococică B (SEB) a fost clasificată în categoria B a agenților implicabili în bioterorism, conform propunerii CDC (www.emergency.cdc.gov/agent/agentlist.asp.). Caracteristicile substanțelor astfel clasificate ar fi următoarele:

pot fi ușor diseminate;

conduc la rate medii de morbiditate și rate scăzute de mortalitate;

nu sunt ușor de evidențiat/ diagnosticat/ identificat în stadiile inițiale; ca atare, sunt necesare eforturi de îmbunătățire a testelor de diagnostic. În același timp, existența acestor substanțe demonstrează necesitatea susținerii și întăririi sistemelor de supraveghere epidemiologică pentru sănătatea publică.

Dintre modalitățile de bioagresiune, diseminarea prin aerosoli este cea mai eficientă, calea digestivă (alimente, apă de băut) fiind considerată a doua cale majoră. Alimentul creează, ipotetic, premisele unei agresiuni de mare amploare. Astfel, într-un studiu într-un studiu dedicat acestei probleme, Wiser și colab. semnalează că, din 82 de acte de bioagresiune, 28 au fost induse prin alimente sau apă de băut și doar două prin aerosoli(14).

Manifestări clinice

Ingestia alimentelor ce conţin o cantitate suficientă de enterotoxine preformate(5) este urmată de apariţia toxiinfecţiei alimentare (TIA) stafilococice(15). Simptomele caracteristice au un debut brusc la 2-8 ore de la ingestia alimentelor contaminate(4), uneori chiar și mai repede, fiind reprezentate de: greaţă, vărsături uneori incoercibile, crampe abdominale cu sau fără diaree(16) generate de cantităţi mici sau foarte mici de enterotoxină (20-100 nanograme). Carnea și produsele din carne, ouă și produse din ouă, lapte și produse din lapte, produse de patiserie, creme, îngheţate, salate, ciuperci și diverse umpluturi pentru sendviș, pește și produse din pește, produse sărate sunt alimentele cel mai frecvent implicate în producerea TIA stafilococice. Prezenţa S. aureus în aliment, la o temperatură prielnică, permite multiplicarea rapidă a microorganismelor, urmată de sinteza toxinelor. Toxigeneza este amplificată de alimentele cu conţinut proteic ridicat, de pH-ul neutru și de absenţa florei care ar putea să inhibe multiplicarea stafilococică(17).

TIA stafilococică este de obicei autolimitantă, simptomele putând să dispară la circa 24-48 de ore de la debut. Au fost raportate și cazuri cu evoluţie severă, cu spitalizare, în special la copii, bătrâni sau la persoane cu imunitatea deprimată(16).

Inhalarea enterotoxinei B aerosolizată produce un sindrom cu manifestări clinice nespecifice ce pot apărea la 2-12 ore post-expunere, cu debut pseudogripal: febră, frison, mialgii, cefalee, tuse neproductivă de intensitate moderată, vindecarea fiind completă la circa două săptămâni. Inhalarea de doze mai mari determină dispnee, dureri retrosternale, tuse neproductivă cu durată de până la 4 săptămâni sau chiar simptomatologie severă: febră asociată sau nu cu mialgii, edem pulmonar, sindrom de detresă res­piratorie acută sau șoc toxico-septic(18). Expunerea oculară poate produce conjunctivită.

În timpul Războiului Rece, depozitele armatei SUA includeau cantități de SEB, motivele pregătirii în acest sens fiind: facilitatea obținerii toxinei (din supernatantul de cultură al tulpinilor de S. aureus producătoare de SEB), stabilitatea acesteia și posibilitatea de utilizare sub formă aerosolizabilă. Cantități foarte mici de enterotoxină (0,004 µg/kg corp) pot provoca simptome debilitante, iar o doză de 0,02 µg/kgcorp poate fi letală(19). Modelul animal pentru studiul afecțiunilor produse de administrarea SEB pe cale inhalatorie este reprezentat de specia Macaca mulatta, primatele imunizate cu microsfere conținând SEB dezvoltând sindrom de șoc toxic la 48 de ore după expunere (au fost descrise și efecte după expunerea accidentală a personalului din laborator).

În cadrul „Offensive Biological Warfare Program“(20), au avut loc trei expuneri accidentale ale personalului din laboratoare la aerosoli cu SEB, astfel:

în 1963, nouă persoane au fost expuse la aerosoli conținând SEB, prin deteriorarea unui dispozitiv folosit în laborator pentru aerosolizare; două dintre acestea au prezentat febră, cefalee și manifestări gastrointestinale, ce au dispărut după 72 de ore;

într-un alt incident ce a avut loc tot în anul 1963, persistența enterotoxinei în blana maimuțelor a fost explicația apariției manifestărilor clinice la cinci din cele șapte persoane dintr-un laborator în care se desfășurau experimente. Simptomele au fost: febră, tuse uscată, dispnee, dureri retrosternale, diaree și vărsături; în patru cazuri a fost necesară spitalizarea;

cel de-al treilea incident din cadrul acestui program a avut loc în 1964, fiind expuse 15 persoane, 10 dintre acestea prezentând manifestările clinice descrise anterior, 9 necesitând spitalizare. Evoluția acestor cazuri a fost favorabilă, cu dispariția simptomelor în 3-5 zile.

Diagnosticul de certitudine necesită coroborarea datelor clinice cu cele epidemiologice și cele paraclinice (de laborator). Testele de laborator sunt nespecifice (leucocitoză cu neutrofilie și creșterea valorii reactanților de fază acută, ex.: VSH). În cazul expunerilor severe, radiografia cardio-toraco-pulmonară poate evidenţia edem interstiţial.

Enterotoxinele sunt proteine foarte stabile. Ca atare, enterotoxinele stafilococice pot fi detectate în primele ore după expunere în diverse produse care se recoltează și se analizează de la cazurile suspecte: ser, exsudat nazal, aspirat traheal, spută sau lichid de lavaj bronhoalveolar, aspirat gastric, materii fecale, urină, fragmente de ţesut/ conţinut intestinal, prelevate alimentare, prelevate din mediu: aer, apă, sol, pulberi.

Detectarea enterotoxinelor stafilococice poate fi realizată prin mai multe metode:

  • teste in vivo (pe model animal);
  • metode imunologice;
  • metode utilizând biosenzori;
  • metode bazate pe detectarea acizilor nucleici;
  • metode fizico-chimice (spectrometria de masă, cromatografia lichidă de înaltă performanță).

Având în vedere faptul că S. aureus se poate izola de la persoane sănătoase, dar și din mediu, punerea în evidență a S. aureus în produse alimentare și/sau în produse patologice nu este suficientă pentru incriminarea acestui germen în producerea TIA sau a altor manifestări toxice. Ca atare, pentru a certifica implicarea toxinelor specifice este necesară evidenţierea potenţialului enterotoxigen (prin tehnici de biologie moleculară) sau detectarea enterotoxinelor prin reacții antigen-anticorp sau alte abordări prin tehnici moderne.

Tratament

Nu există tratament specific atunci când SEB sunt utilizate ca agent de bioagresiune. Se poate recurge doar la un tratament simptomatic, însoțit de reechilibrarea hidroelectrolitică. În cazurile severe, persoanele afectate vor fi internate în spital și vor fi ținute sub observație în unități de terapie intensivă; uneori fiind necesară inclusiv asistarea respiratorie.

Profilaxie

Cu toate că riscul de deces după expunere la SEB este relativ scăzut, încă din 1960 se studiază modalități de obținere a unor vaccinuri eficiente care să asigure titruri protectoare de anticorpi antienterotoxină B. Astfel, în SUA, în 1960, a fost dezvoltat un vaccin ce conținea enterotoxină B inactivată prin tratare cu formalină, cu eficacitate dovedită în studiile in vivo, dar care nu a fost aprobat pentru uz uman(21). Au mai fost dezvoltate variante pentru administrare subcutanată și 30 de ani mai târziu a fost pusă la punct și o variantă care se poate administra intramuscular, ambele asigurând un răspuns protector acceptabil, fără efecte adverse majore(22, 23). Încercând să se elimine eventualele reacții adverse, a fost pusă la punct și o variantă de vaccin cu administrare intranazală; totuși, rezultatele nu au fost încurajatoare, deoarece administrarea acestui vaccin a indus un răspuns slab din partea organismului. Din 2003, se încearcă dezvoltarea unor vaccinuri folosind proteine recombinante, care să nu exprime capacitatea toxică, dar să fie suficient de imunogene, astfel încât să asigure titruri eficiente de anticorpi antienterotoxină.

Concluzii

Din cauza faptului că S. aureus se poate izola de la persoane sănătoase și uneori și din mediu, iar simptomatologia produsă de enterotoxina B nu este specifică și poate fi similară unui mare număr de alte afecţiuni, demonstrarea implicării SEB într-un posibil episod de bioagresiune este dificilă. Însă, datorită faptului că aceste toxine stafilococice au fost incluse în clasa B a agenţilor de bioagresiune, este necesară o supraveghere atentă a mediului, precum și cunoașterea măsurilor de profilaxie și tratament al afecţiunilor produse de acești agenţi. Colaborarea între medicii microbiologi, medicii epidemiologi și toți colegii implicați în sănătatea publică la nivel regional și național este esențială. 

Conflict of interests: The authors declare no conflict of interests.

Bibliografie

  1. Howe CW. Experimental studies on determinants of wound infection. Sur  Gyn Obst. 1966;123(3):507-14.
  2. Le Loir Y, Baron F, Gautier M. Staphylococcus aureus and food poisoning. Gen Mol Res. 2003;2(1):63-76.
  3. Kusch H, Engelmann S. Secrets of the secretome in Staphylococcus aureus. Ing J Med Microbiol. 2014;304(2):133-41.
  4. Balaban N, Rasooly A. Staphylococcal enterotoxins. Int J Food Microbiol. 2000;61(1):1-10.
  5. Argudin MA, Mendoza MC, Rodicio MR. Food poisoning and Staphylococcus aureus enterotoxins. Toxins. 2010;2(7):1751-73.
  6. Mauff G, Rohrig I, Ernzer U, et al. Enterotoxigenicity of Staphylococcus aureus strains from clinical isolates. Eur J Clin Microbiol. 983;2(4):321-6.
  7. Derzelle S, Dilasser F, Duquenne M, Deperrois V. Differential temporal expression of the staphylococcal enterotoxins genes during cell growth. Food Microbiol. 2009;26(8):896-904. 
  8. Orwin PM, Fitzgerald JR, Leung DY, et al. Characterization of Staphylococcus aureus enterotoxin L. Inf Immun. 2003;71(5):2916-9.
  9. Swaminathan S, Furey W, Pletcher J, Sax M. Residues defining V beta specificity in staphylococcal enterotoxins. Nature Struct Biol. 1995;2(8):680-6.
  10. Fields BA, Malchiodi EL, Li H, et al. Crystal structure of a T-cell receptor beta-chain complexed with a superantigen. Nature. 1996;384(6605):188-92. 
  11. Labrecque N, Thibodeau J, Mourad W, Sekaly RP. T cell receptor-major histocompatibility complex class II interaction is required for the T cell response to bacterial superantigens. J Exp Med. 1994;180(5):1921-9.
  12. Thibodeau J, Cloutier I, Lavoie PM, et al. Subsets of HLA-DR1 molecules defined by SEB and TSST-1 binding. Science. 1994;266(5192):1874-8.
  13. Hu DL, Nakane A. Mechanisms of staphylococcal enterotoxin-induced emesis. Eur J Pharma. 2014;722:95-107.
  14. Wiser I, Balicer RD, Cohen D. An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies. Vaccine. 2007;25(6):976-84.
  15. Dinges MM, Orwin PM, Schlievert PM. Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev. 2000;13(1):16-34.
  16. Murray RJ. Recognition and management of Staphylococcus aureus toxin-mediated disease. Int Med J. 2005;35 Suppl 2:S106-19.
  17. Schelin J, Wallin-Carlquist N, Cohn MT, et al. The formation of Staphylococcus aureus enterotoxin in food environments and advances in risk assessment. Virulence. 2011;2(6):580-92.
  18. Rajagopalan G, Smart MK, Patel R, David CS. Acute systemic immune activation following conjunctival exposure to staphylococcal enterotoxin B. Inf Immun. 2006;74(10):6016-9.
  19. Weng CF, Komisar JL, Hunt RE, et al. Immediate responses of leukocytes, cytokines and glucocorticoid hormones in the blood circulation of monkeys following challenge with aerosolized staphylococcal enterotoxin B. Int Immunol. 1997;9(12):1825-36.
  20. Rusnak JM, Kortepeter M, Ulrich R, et al. Laboratory exposures to staphylococcal enterotoxin B. Emerg Inf Dis. 2004;10(9):1544-9.
  21. Silverman SJ, Moore GT, Roessler WG. Effect of formaldehyde on the immunogenicity of staphylococcal enterotoxin B for Macaca mulatta. J Bact. 1969;98(2):443-6.
  22. Tseng J, Komisar JL, Trout RN, et al. Humoral immunity to aerosolized staphylococcal enterotoxin B (SEB), a superantigen, in monkeys vaccinated with SEB toxoid-containing microspheres. Inf Immun. 1995;63(8):2880-5.
  23. Tseng J, Komisar J, Chen JY, et al. Immunity to aerosolized staphylococcal enterotoxin B. Adv Exp Med Biol. 1995;371B:1615-9.