Evaluarea statusului imun în patologia infecţioasă la câine

1. Criterii de selecţie a metodei de testare a reactivităţii imunologice

Evaluarea structurilor şi proceselor biologice implicate în sistemul care protejează un organism împotriva bolilor - numit sistem imun - se realizează prin tehnici specifice imunologiei clinice şi reprezintă un domeniu important al cercetării biomedicale. Aceste tehnici au pătruns greu în laboratoarele de diagnostic deoarece ele implică o activitate complexă şi sunt în general costisitoare.

Aprecierea statusului imun al unui organism presupune investigarea relaţiei dintre un antigen sau un imunogen şi reactivitatea imunologică a organismului, respectiv capacitatea lui de a induce un răspuns mediat umoral şi/sau celular. Pentru evaluarea răspunsului imun umoral se studiază interacţiunea dintre antigene şi anticorpi, în timp ce pentru imunitatea celulară se determină numărul total de limfocite, subclasele limfocitelor T, citokinele etc.

Depistarea carenţelor de funcţionare ale sistemului imun furnizează clinicianului informaţii utile în diagnosticul şi prognosticul a două mari categorii de afecţiuni:

n imunodeficienţe, rezultate în urma diminuării congenitale sau dobândite a stării de imunitate a organismului, astfel încât sistemul imun nu reuşeşte să ofere un răspuns adecvat agenţilor patogeni; un exemplu de imunodeficienţă este boala granulomatoasă cronică;

n boli autoimune, în care sistemul imunitar devine „confuz” şi atacă sau distruge în mod eronat celule proprii organismului (de exemplu, lupusul eritematos sistemic).

Reactivitatea imunologică poate fi testată prin tehnici imunoserologice şi/sau tehnici imunocitologice. În alegerea metodei de testare a structurii şi funcţiilor sistemului imun sunt importante o serie de criterii de natură tehnică şi/sau economică.

Criterii de natură tehnică

Deoarece fiecare metodă de evaluare a statusului imun are propriile exigenţe, avantaje, limite şi sensibilitate, în stabilirea unui diagnostic real, clinicianul poate aplica mai multe variante tehnice, având astfel posibilitatea comparării şi corelării rezultatelor obţinute.

Un prim element în alegerea metodei de apreciere a răspunsului imun al unui organism la antigeni este cunoaşterea tipului de reacţie imunologică implicat în declanşarea lui. În funcţie de reacţia imunologică, un organism poate manifesta trei tipuri de răspuns imun:

• Răspunsul imun primar, care este determinat strict în momentul intrării antigenului în organism, prin fixarea anticorpului specific; prima interacţiune antigen-anticorp induce formarea unor celule de memorie cu specificitate pentru antigenul respectiv.
• Răspunsul imun secundar urmează răspunsului imun primar şi implică activarea celulelor de memorie generate anterior; el este un proces mult mai rapid şi mai eficient decât răspunsul primar.
• Răspunsul imun terţiar este un proces mai complex, determinat de prezenţa controlată a unui imunogen în organismul animalului.

Principalele metode de evaluare a răspunsului imun primar sunt:

• Dozarea antigenului prin teste radioimunologice
• Detectarea anticorpilor prin teste radioimunologice
• Imunofluorescenţă directă şi indirectă
• Teste imunoenzimatice.

Evaluarea cantitativă şi calitativă a răspunsului imun secundar se poate realiza prin tehnici care implică:

• Imunoprecipitarea complexului antigen-anticorp în mediu solid şi semisolid
• Imunoaglutinarea
• Reacţia de fixare a complementului
• Reacţia de inhibare a hemaglutinării.

Deoarece răspunsul imun terţiar este dependent de o serie de variabile caracteristice fiecărui animal, evaluarea lui presupune teste in vivo, realizate în general prin:

• Reacţia hiperbazofilică
• Reacţia de hipersensibilitate de tip întârziat.

Un alt element, la fel de important în alegerea metodei de apreciere a răspunsului imun, este sensibilitatea tehnicii imunologice aplicate. Nivelul de sensibilitate al unei tehnici de analiză imunologică se apreciază în general în funcţie de cantitatea minimă de anticorpi decelată (tabelul 1). Ea poate fi influenţată de o serie de factori manifestaţi independent de protocolul de lucru: natura sistemului antigen-anticorp investigat, calitatea reactivilor utilizaţi, modul de manipulare a aparaturii implicate şi performanţele tehnice ale acesteia.

Criterii de natură economică

Complexitatea tehnicilor de imunodiagnostic veterinar implică utilizarea unei aparaturi performante şi a unor reactivi de înaltă calitate, ceea ce determină costuri mai mult sau mai puţin ridicate pentru evaluarea statusului imun. Chiar dacă respectivele costuri reprezintă un factor important în selecţia metodei de analiză imunologică, ele determină, în general, acurateţea rezultatelor obţinute.

Un diagnostic imunologic obişnuit nu presupune o metodologie foarte costisitoare. Principalele tehnici care asigură o sensibilitate ridicată în evaluarea statusului imun la costuri nu foarte mari sunt atât metodele clasice de precipitare şi aglutinare imună, cât şi reacţia de fixare a complementului. O reducere a cheltuielilor aferente unei tehnici de imunodiagnostic se poate obţine dacă în laboratorul respectiv este posibilă prepararea reactivilor necesari în regim propriu şi numărul probelor analizate este suficient de mare. Pentru evaluarea răspunsului imun prin tehnici de imunofluorescenţă, imunoenzimatice sau radioimunologice este necesară achiziţionarea unei aparaturii specifice şi a kiturilor aferente, ceea ce determină costuri uşor mai ridicate. 

La fel de important în asigurarea unor costuri reduse este nivelul de pregătire al personalului care deserveşte laboratorul de diagnostic imunologic. Pentru aplicarea metodelor complexe de evaluare a statusului imun sunt necesare cunoştinţe fundamentale din domeniul imunologiei, dar şi o anumită experienţă în practica de specialitate, care să permită o interpretare corectă a rezultatelor şi un diagnostic real.

2. Teste de evaluare a imunităţii mediate umoral

Determinarea calitativă a imunoglobulinelor serice

Aplicând tehnica de imunofluorescenţă simplă, se obţin date care oferă informaţii legate de prezenţa moleculelor de imunoglobuline într-un ser sau în alte lichide biologice. Este incorectă aprecierea cantitativă a proteinelor serice prin examinarea şi interpretarea morfologiei sau intensităţii liniilor de precipitare, deoarece aspectul lor este influenţat şi de alţi factori (concentraţia diferită a suspensiilor utilizate, de distanţa dintre şanţ şi godeu etc.).

O analiză calitativă a imunoglobulinelor serice se poate obţine şi prin tehnici serologice bazate pe fenomenul de aglutinare, urmată de precipitare imună.

Determinarea cantitativă a imunoglobulinelor serice

Există mai multe metode prin care se poate face o cuantificare a moleculelor de imunoglobulină. O parte dintre aceste metode permit aprecieri semicantitative (reacţia de aglutinare lentă, imunodifuzia radială dublă) sau cantitative (imunodifuzie radială simplă, ELISA, nefelometrie). Aplicarea acestor tehnici permite obţinerea unor rezultate care pot fi comparate cu valorile etaloanelor proteice veritabile. În lipsa acestor valori-etalon se recomandă efectuarea prealabilă a unor testări de referinţă de la aceeaşi specie cu cea testată şi compararea ulterioară a valorilor obţinute.

Indiferent de metoda de analiză aplicată pentru determinarea cantitativă a imunoglobulinelor serice, în interpretarea rezultatelor obţinute se au în vedere următoarele aspecte:

• valorile medii sau etalon sunt în general orientative, deoarece ele pot avea limite destul de largi, datorate vârstei sau stării de întreţinere a animalelor;
• la animalele nou-născute, nivelul imunoglobulinelor serice este mult mai redus sau chiar nedetectabil prin tehnici clasice de imunodiagnostic. După administrarea colostrului, nivelul IgG-ului seric este în general superior celui măsurat la animalele adulte din aceeaşi specie, nivelul IgM-ului este aproximativ egal, în timp ce valorile IgA-ului rămân inferioare;
• o concentraţie a imunoglobulinelor serice mai mică cu 50% decât cea înregistrată la animale din aceeaşi specie, cu aceeaşi vârstă şi condiţii de întreţinere este interpretată ca indicator al unei deficienţe imunoglobulinice;
• o concentraţie mare a imunoglobulinelor serice poate fi generală, implicând toate clasele de imunoglobuline sau se poate limita la un singur izotip. Moleculele cuantificate pot fi de tip monoclonal sau policlonal, în funcţie de numărul clonelor de limfocite B participante;
• hipergamaglobulinemia policlonală poate fi determinată de infecţii cronice, parazitoze şi uneori de boli autoimune;
• creşteri mai mult sau mai puţin limitate la o clasă particulară de imunoglobuline pot indica un diagnostic general care sugerează helmintoze (pentru IgG), infecţii cu protozoare (pentru IgM) şi infecţii ale mucoaselor (pentru IgA);
• creşteri de tip monoclonal ale titrului seric de imunoglobuline pot apărea în mieloame şi plasmocitoame.

Titrarea complementului total sau a componentelor sale

Componentele sistemului complement pot fi analizate calitativ şi cantitativ prin tehnici de imunodifuzie radială, numai dacă există seruri corespunzătoare, standardizate la concentraţii cunoscute.

Dacă absenţa unui singur component al sistemului poate determina o deficienţă funcţională totală, reducerea cantitativă a unui singur component nu modifică profund eficienţa sistemului. Practic, evaluarea cantitativă nu oferă informaţii legate de funcţionalitatea componentelor specifice. Nivelul mediu al complementului hemolitic măsurat la animalele de companie, prin tehnici de mare sensibilitate, se exprimă în unităţi hemolitice 50% (UH 50%/ml).

3. Teste de evaluare a imunităţii mediate celular

Efectorii celulari ai imunităţii pot fi apreciaţi în funcţie de încadrarea valorilor absolute în limite normale. De aceea se impune un test preliminar, în vederea cuantificării numărului exact de celule existent în proba de sânge analizată.

Determinarea numărului total de leucocite şi stabilirea formulei leucocitare sunt etape care pot oferi date valoroase legate de proporţia celulelor analizate.

Investigarea unui număr redus de parametri imunologici este insuficientă pentru un imunodiagnostic real. În general, pentru evaluarea imunităţii mediate celular sunt necesare teste complexe, care pot analiza funcţiile fagocitare sau limfocitare, pot oferi informaţii despre potenţialul de blastizare şi/sau teste de citotoxicitate.

Determinarea activităţii fagocitare

Activitatea fagocitară reprezintă un parametru important în evaluarea funcţiilor imune, activitate în care sunt implicate două categorii celulare distincte: neutrofilele şi celulele reprezentate de seria monocite-macrofage.

Testele utilizate în mod frecvent pentru evaluarea fagocitozei la neutrofile sunt bazate pe tehnicile de migrare în strat filtrant şi sub strat de agaroză. La acestea se adaugă tehnicile de înglobare şi de explorare funcţională a metabolismului oxidativ, prin chemiluminescenţă.

În seria monocitelor-macrofagelor, evaluarea funcţională a fagocitozei urmăreşte capacitatea de locomoţie sau migrarea prin tub capilar şi prin strat filtrant, capacitatea de endocitoză sau înglobarea particulelor de carbon sau a hematiilor heterologe, dar şi potenţialul metabolismului oxidativ prin chemiluminescenţă.

Din păcate, nu există un normativ unanim acceptat pentru interpretarea rezultatelor la aceste teste, în special la animalele de companie.

Determinarea activităţii limfocitare

Tehnicile de separare celulară permit stabilirea raportului între populaţiile de limfocite T şi B. Prin citometrie de flux pot fi determinate şi subpopulaţii limfocitare cu rol reglator sau efector.

Interpretarea corectă a rezultatelor implică evitarea confuziei semnalate frecvent între limfocitele B şi alte celule care au receptori de membrană pentru fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulină. Pentru aceasta se recomandă folosirea în reacţie a fragmentului Fab sau folosind în exces moleculele de imunoglobulină nemarcate, care au aceeaşi origine cu cea a donatorilor de antiser.

La majoritatea animalelor de companie, limfocitele B sunt prezente într-un procent redus din totalul limfocitelor periferice (10-20%).

Limfocitele T formează majoritatea limfocitelor periferice, indiferent de specia animalului la care s-a făcut evaluarea. Limfocitele Th sunt mai numeroase decât limfocitele Ts, cu menţiunea că, în mod normal, raportul între aceste celule este subunitar. În cazul imunodeficitelor dobândite, raportul se inversează, explicând instalarea unor stări de imunosupresie.

Alături de limfocite T şi B, un procent important în sângele periferic este reprezentat de celule nule, lipsite de markerii caracteristici celulelor imunopotente.

Capacitatea funcţională a limfocitelor poate fi evaluată şi prin testele de transformare blastică, în care celulele limfocitare sunt puse în contact cu substanţe mitogene. Aceste teste oferă informaţii despre funcţionalitatea limfocitelor, dar aplicarea lor necesită aparatură specială şi personal cu înaltă calificare.

Determinarea activităţii citotoxice

Celulele citotoxice reprezintă o populaţie redusă de mononucleare circulante sau fixe, care au capacitatea de a distruge celule-ţintă modificate patologic. Prin teste de citotoxicitate pot fi evaluate limfocitele T citotoxice, celulele K, celulele NK şi macrofagele. Deoarece citoliza se cuantifică prin marcare radioactivă, aceste teste sunt mai laborioase şi costisitoare, necesitând aparatură şi reactivi specifici, precum şi un personal cu înaltă specializare. Cu toate acestea, în ultimul timp, respectivele teste sunt frecvent utilizate, deoarece rezultatele obţinute reprezintă un indicator valoros pentru evaluarea potenţialului imunitar al organismului.