Știri

Implementarea unui protocol de tip Real-Time PCR cuplat cu analiza curbei de topire pentru evaluarea clonalităţii populaţiei de limfocite la câine

Limfomul canin reprezintă un grup eterogen de cancere, fiind totodată printre cele mai frecvent diagnosticate, cu o prevalenţă în intervalul 7-14%.
Lavinia Pricop, Mario-Darius Codreanu
30 Septembrie 2023
Știri
30 Septembrie 2023

Implementarea unui protocol de tip Real-Time PCR cuplat cu analiza curbei de topire pentru evaluarea clonalităţii populaţiei de limfocite la câine

Limfomul canin reprezintă un grup eterogen de cancere, fiind totodată printre cele mai frecvent diagnosticate, cu o prevalenţă în intervalul 7-14%.
Lavinia Pricop, Mario-Darius Codreanu

Din aceeași categorie

Practica Veterinara.ro

Arcul aortic drept persistent: diagnostic și rezolvare chirurgicală

Practica Veterinara.ro

Managementul clinic și de diagnostic al sindromului Cushing la câine

Practica Veterinara.ro

Coordonate clinice și de diagnostic în principalele afecţiuni urologice la câine

Introducere

Limfomul canin reprezintă un grup eterogen de cancere, fiind totodată printre cele mai frecvent diagnosticate, cu o prevalenţă în intervalul 7-14%. Există peste 30 de tipuri descrise de limfom canin, cu un comportament extrem de divers, unele beneficiind de o evoluţie rapidă, sub formă acută şi de cele mai multe ori incompatibile cu supravieţuirea, în timp ce altele evoluează lent, cronic(10). Din punctul de vedere al diagnosticului, detecţia unui număr mare de celule tumorale este posibilă utilizând metodele de diagnostic curente, inclusiv examenul citologic şi/‌sau flowcitometria(6,7,8,11), totuşi caracterizarea unui număr redus de celule implică utilizarea unor tehnici genetice ce prezintă avantajul sensibilităţii net superioare în identificarea reasortării receptorilor pentru antigen(2,8). Testul PARR (PCR for Antigen Receptor Rearrangements) este termenul uzual folosit pentru astfel de tehnici în medicina veterinară, cu menţiunea că nu există o astfel de terminologie în medicina umană(1,2).

Mecanismul genetic al reasortării receptorilor a fost elucidat în anul 1987 de către cercetătorul japonez Susumu Tonegawa, ulterior recompensat cu Premiul Nobel, şi are la bază fenomene de modelare a receptorilor de pe suprafaţa limfocitelor T sau a imunoglobulinelor produse subsecvent de limfocitele B (plasmocite), astfel încât fiecare receptor să recunoască în mod specific un anumit antigen. Regiunile genetice care codifică situsul de legare antigenică variază la nivelul populaţiei de limfocite mature, atât ca lungime, cât şi ca secvenţă nucleotidică, şi sunt consecinţa recombinării a trei segmente genetic distincte: V, D şi, respectiv, J. Secvenţa genetică pentru fiecare receptor este compusă din una dintre variantele segmentului V (aproximativ 80 de astfel de variante au fost descrise la câine), una dintre variantele segmentului D (în total, şase la câine) şi una dintre variantele segmentului J (cinci pentru câine), între care sunt adăugate un număr variabil de nucleotide suplimentare (figura 1A)(1). Aşadar, unicitatea fiecărui receptor este dată de una dintre combinaţiile posibile dintre cele trei segmente, la care se adaugă un număr variabil de nucleotide, fapt ce face ca fragmentul final să aibă dimensiuni extrem de variabile şi semnificative.

Într-o populaţie normală de limfocite stimulate antigenic, o şuşă de limfocite stimulate pentru acelaşi antigen va avea o structură unică şi total diferită faţă de celelalte (atât ca lungime, cât şi ca secvenţă) (figura 1B), în timp ce, în cazul limfomului, fiind vorba de o singură şuşă, întreaga populaţie de limfocite va avea acelaşi tipar genetic (figura 1C). Aşadar, în cazul amplificării prin tehnica PCR a acestui segment, fragmentele amplificate pentru o situaţie fiziologică vor fi numeroase şi cu dimensiuni diferite, în timp ce, pentru limfom, vom avea un singur fragment amplificat de aceeaşi lungime (figura 1D).

În ceea ce priveşte primerii, cel mai frecvent utilizaţi sunt cei pentru amplificarea lanţului greu imunoglobulinic (IgH) pentru limfocitele B, respectiv receptorii gama ai limfocitelor T (TCRy)(2,3,4,5,9,12,13,14).

Extracţia ADN-ului genomic a fost realizată având ca sursă de material biologic raclatul de pe lamele utilizate pentru examenul citologic, prin aplicarea unui protocol customizat (date disponibile la cerere) şi utilizarea tehnologiei QIAamp (Qiagen, Hilden, Germania), cu eluţia ADN-ului într-un volum final de 150µ l. Toate probele au fost examinate anterior (citologie), confirmând sau infirmând suspiciunea de limfom.

Amplificarea (reacţia PCR) a fost realizată utilizând două seturi de primeri pentru regiunile genetice IgH ale limfocitelor B, un set de primeri pentru regiunea TCRy a limfocitelor T şi o regiune de control (Cµ)(8), cu amplificarea în mai multe replicate pentru a contracara eventualele artefacte (două sau trei replicate pentru fiecare regiune amplificată). Kitul utilizat a fost QuantiFast SYBR PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germania), iar ca aparat s-a folosit Q-instrument (QuantaBio, SUA). Profilul termic este prezentat în tabelul 1. Monitorizarea eficienţei şi cineticii reacţiei PCR s-a realizat prin analiza curbelor de amplificare (figura 2). Ulterior, evaluarea clonalităţii a fost realizată prin etapa de topire, cu obţinerea curbelor de topire specifice (figurile 3, 5, 7), respectiv a vârfurilor de topire (figurile 4, 6, 8).
 

Figura 1. A – Fragmentele genetice care stau la baza structurii receptorilor, cu toate combinaţiile posibile la câine. B – Structura genetică a receptorilor într-o populaţie normală de limfocite stimulate antigenic. C – Structura genetică a limfocitelor într-o populaţie malignă de limfocite (se observă aspectul de clonalitate prin existenţa unei singure variante genetice). D – Reprezentarea sub formă de vârfuri de topire a fragmentelor amplificate (se observă existenţa de vârfuri multiple cu amplitudine redusă în situaţiile fiziologice cu stimulare antigenică multiplă, în comparaţie cu situaţiile patologice, unde se observă un singur vârf de topire cu amplitudine semnificativă)
Figura 1. A – Fragmentele genetice care stau la baza structurii receptorilor, cu toate combinaţiile posibile la câine. B – Structura genetică a receptorilor într-o populaţie normală de limfocite stimulate antigenic. C – Structura genetică a limfocitelor într-o populaţie malignă de limfocite (se observă aspectul de clonalitate prin existenţa unei singure variante genetice). D – Reprezentarea sub formă de vârfuri de topire a fragmentelor amplificate (se observă existenţa de vârfuri multiple cu amplitudine redusă în situaţiile fiziologice cu stimulare antigenică multiplă, în comparaţie cu situaţiile patologice, unde se observă un singur vârf de topire cu amplitudine semnificativă)











 

Profilul termic al reacţiei PCR
Profilul termic al reacţiei PCR










 

Figura 2. Portocaliu = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelr B. Verde = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T.
Figura 2. Portocaliu = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelr B. Verde = curbele de amplificare obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T.










 

Figura 3. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T .Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control, în timp ce pentru IgHM, IgHm şi TCRy scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente şi, implicit, aspectul de reactivitate limfocitară fiziologică.
Figura 3. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T .Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control, în timp ce pentru IgHM, IgHm şi TCRy scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente şi, implicit, aspectul de reactivitate limfocitară fiziologică.











 

Figura 4. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control, în timp ce pentru IgHM, IgHm şi TCRy se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente şi, implicit, aspectul de reactivitate limfocitară fiziologică.
Figura 4. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control, în timp ce pentru IgHM, IgHm şi TCRy se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente şi, implicit, aspectul de reactivitate limfocitară fiziologică.











 

Figura 5. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control şi regiunea IgH M, sugerând amplificarea unui singur fragment, în timp ce pentru IgHm şi TCRy scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip B cu origine IgH major
Figura 5. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control şi regiunea IgH M, sugerând amplificarea unui singur fragment, în timp ce pentru IgHm şi TCRy scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip B cu origine IgH major











 

Figura 6. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control şi IgH M, în timp ce pentru IgHm şi TCRy se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip B cu origine IgH major
Figura 6. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control şi IgH M, în timp ce pentru IgHm şi TCRy se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip B cu origine IgH major











 

Figura 7. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control şi regiunea TCRy, sugerând amplificarea unui singur fragment, în timp ce pentru IgHM şi IgHm scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip T
Figura 7. Portocaliu = curbele de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = curbele de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = curbele de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T. Se observă scăderea bruscă, unitară, a fluorescenţei pentru regiunea de control şi regiunea TCRy, sugerând amplificarea unui singur fragment, în timp ce pentru IgHM şi IgHm scăderea fluorescenţei este graduală, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip T











 

Figura 8. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T.S e observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control şi TCRy, în timp ce pentru IgHM şi IgHm se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip T.
Figura 8. Portocaliu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea de control (Cµ). Negru = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH major a limfocitelor B. Roşu = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea IgH minor a limfocitelor B. Verde = vârfurile de topire obţinute pentru regiunea TCRy a limfocitelor T.S e observă existenţa unui singur vârf de topire cu amplitudine mare pentru regiunea de control şi TCRy, în timp ce pentru IgHM şi IgHm se poate observa existenţa de vârfuri de topire multiple şi cu amplitudine mai redusă, sugerând amplificarea mai multor fragmente. Aspect caracteristic pentru un limfom de tip T.








Conflict de interese: niciunul declarat  
Suport financiar: niciunul declarat
Acest articol este accesibil online, fără taxă, fiind publicat sub licenţa CC-BY.

PCRclonalitatelimfocitelimfom
Te-ar mai putea interesa
Știri
Știri

APCR: Fără acțiune fermă și solidară, România nu poate ieși din criza de sănătate în care se află

APCR propune încheierea unui acord transpartinic, care „să scoată sănătatea din logica electorală și să o așeze în centrul priorităților naționale”.

...

Citește mai departe
Știri
Știri

Caravana medicală „Sănătatea vine la tine”: peste jumătate dintre cei testaţi au diabet sau prediabet

Peste 1.200 de persoane din mediul rural au beneficiat, prin intermediul celei de a treia ediţii a Caravanei „Sănătatea vine la tine”, de testări medicale gratuite. Acestea au arătat că mult de jumătate dintre cei testaţi suferă de prediabe...

Citește mai departe
Comunicate de presă
Comunicate de presă

Caravana „Sănătatea vine la tine”: peste 1.000 de persoane vor beneficia de controale medicale gratuite

Peste 1.000 de persoane din mediul rural vor beneficia în perioada martie - iunie de controale medicale gratuite pentru diabet zaharat, boli cardiovasculare, obezitate şi hepatita B şi C în cadrul caravanei „Sănătatea vine la tine„ - un pro...

Citește mai departe