Din aceeași categorie

Alergologia

Alergia la excipienţi medicamentoși

Alergologia

Reacţiile de hipersensibilitate la antiinflamatoare nesteroidiene

Alergologia

Sindromul de hipersensibilitate sau sindromul DRESS indus de anticonvulsivante

Introducere

Imunoterapia alergen-specifică (AIT) este singurul tratament care influenţează mecanismele imunitare ale alergiei, prin modularea inflamaţiei de tip 2, stimulând producţia de anticorpi blocanţi IgG şi prin inducerea celulelor T reglatoare specifice, ceea ce determină efecte de lungă durată şi prevenirea progresiei bolii de la rinită la astm sever (Flicker et al., 2011; Sancho et al., 2017; Valenta et al., 2012).

Imunoterapia alergen-specifică pe bază de peptide este o abordare moleculară pentru AIT şi o alternativă la AIT cu alergene întregi. Aceasta utilizează peptide sintetice mici reprezentând epitopii pentru limfocitele T şi B din alergenul-ţintă, cu capacitatea de a induce toleranţa şi imunoreglarea celulelor T şi, respectiv, anticorpii blocanţi IgG (Valenta et al., 2010; Zhernov et al., 2019). În timp ce imunoterapia bazată pe peptide ajută la reducerea riscurilor de reacţii adverse severe şi oferă o eficienţă îmbunătăţită şi confort de administrare în comparaţie cu AIT pe bază de extract, identificarea candidaţilor de peptide adecvate pentru imunoterapie implică timp şi costuri considerabile. Abordări computaţionale pentru maparea in silico a epitopilor T şi B au fost utilizate anterior în alergologie (Chen et al., 2014), oncologie (Kardani et al., 2020) şi în studiul bolilor infecţioase (Kardani et al., 2020) şi pot ajuta la reducerea timpului şi a costurilor dezvoltării de imunoterapii prin indicarea celor mai potrivite peptide-candidat pentru vaccinul bazat pe epitopi (Sanchez-Trincado et al., 2017).

În prezent, pentru pacienţii alergici la ambrozie, singurul tratament AIT disponibil este cel bazat pe extracte alergenice. Acest tratament are însă multe dezavantaje şi, prin urmare, doar puţini pacienţi pot beneficia de AIT. Principalele puncte slabe ale AIT pe bază de extracte sunt extractele de alergeni adesea lipsite de alergenele relevante clinic, rezultând doar o protecţie parţială a pacienţilor sensibilizaţi (Focke et al., 2009) şi extractele conţinând mai multe alergene potente care pot provoca efecte secundare severe (Valenta et al., 2012). Alergenele naturale pot induce nu numai IgG-uri specifice, care este scopul terapiei, ci şi reacţii alergice imediate datorate epitopilor lor pentru anticorpii IgE şi reacţii cutanate de fază târzie datorate epitopilor lor pentru limfocite T (Valenta et al., 2010; Zhernov et al., 2019)

Pentru reducerea efectelor secundare, AIT pe bază de extract necesită administrarea de mai multe doze cu concentraţii crescătoare, ceea ce are ca rezultat programe de tratament încărcate şi complianţa slabă a pacienţilor la tratament.

Pentru alergia la ambrozie, anterior a fost testată eficacitatea unui vaccin dintr-o serie recent identificată de epitopi T din alergenul major de ambrozie Amb a 1 (ToleroMune Ragweed) în atenuarea simptomelor de rinoconjunctivită alergică (Hafner et al., 2012). Vaccinul a fost bine tolerat şi a redus simptomele de rinoconjunctivită la pacienţii alergici la ambrozie care au fost expuşi la polenul de ambrozie (Hafner et al., 2012). Într-un studiu separat, s-a demonstrat că epitopii T ai alergenului Amb a 1 modulează răspunsurile imunologice la oameni şi la şoareci şi au prezentat reactivitate scăzută la IgE şi alergenicitate in vitro. Epitopii T au fost identificaţi anterior pentru Amb a 1, Amb a 8, Amb a 10 şi Amb a 11, dar nu pentru Amb a 4 şi Amb a 6, alergene din polenul de ambrozie la care aproximativ 30% dintre pacienţii alergici la ambrozie sunt sensibilizaţi (Chen et al., 2018).

Deoarece structura proteică terţiară a Amb a 4 şi Amb a 6 nu a fost încă rezolvată, obiectivul prezentului studiu a fost de a genera structuri terţiare in silico pentru aceste alergene folosind modelarea prin omologie şi de a utiliza aceste modele pentru predicţia in silico a epitopilor B discontinui (epitopi de legare pentru IgE) împreună cu epitopi B şi T liniari continui.

Materiale şi metodă

Modelarea prin omologie

Am generat modele cu serverul I-TASSER pentru predicţia structurii şi funcţiei proteinelor (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/) folosind următoarele modele: alergenul major din Artemisia vulgaris (Art v 1) (PDB: 2KPY) pentru Amb a 4 şi o proteină nespecifică de transport lipidic 1 de la Nicotiana tabacum (PDB: 1T12) pentru Amb a 6. Pentru Amb a 4, modele suplimentare au fost generate folosind programul RaptorX (http://raptorx. uchicago.edu). Modelele de structură generate pentru Amb a 4 şi Amb a 6 au fost evaluate folosind funcţiile de notare QMEANDisCo 14 (https://swissmodel.expasy.org/qmean) şi VoroMQA 15 (http://bioinformatics.ibt.lt/wtsam/voromqa).

Predicţia in silico a epitopilor pentru limfocite B

Pentru predicţia de epitopi liniari continui pentru limfocite B au fost utilizate următoarele programe bioinformatice: Bepipred 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/), BCPreds (http://ailab-projects1.ist.psu.edu:8080/bcpred/predict.html), ABCPred (http://crdd.osdd.net/raghava/abcpred/), Scala de antigenicitate Kolaskar & Tongaonkar (Kolaskar & Tongaonkar, 1990)şi Predicţia Accesibilităţii la Suprafaţă Emini (Emini, Hughes, Perlow, & Boger, 1985) din baza de date şi analiză IEDB (http://tools.iedb.org/bcell/). Peptidele identificate prin Bepipred 2.0 şi validate prin cel puţin alte două metode au fost indicate ca epitopi B.

Epitopii B discontinui au fost prezişi folosind DiscoTope 2.0 (http://tools.iedb.org/discotope/) şi ElliPro (http://tools.iedb.org/ellipro/).

Predicţia in silico a epitopilor pentru limfocite T

Pentru predicţia epitopilor T, secvenţele de aminoacizi ale Amb a 4 şi Amb a 6 (după îndepărtarea secvenţelor corespunzătoare peptidelor de semnalizare) au fost introduse în instrumentul de predicţie al IEDB pentru legarea de MHC clasa II şi predicţia a fost efectuată folosind metoda Consensus 2.2 şi setul complet de referinţă HLA uman (http://tools.iedb.org/mhcii/). Secvenţele de peptide de nouă aminoacizi în lungime (nonameri) cu un rang ajustat sub 10% au fost indicate ca epitop T prezis.

Rezultate

Modelarea prin omologie a alergenelor Amb a 4 şi Amb a 6

Am generat modele de structură terţiară pentru Amb a 4 şi Amb a 6 folosind serverul I-TASSER pentru predicţia structurii şi funcţiei proteinelor şi am ales cele mai bune modele pe baza scorului TM (o scală pentru măsurarea similarităţii structurale dintre două structuri) (Zhang & Skolnick, 2004) alături de estimarea calităţii cu VoroMQA şi QMEANDisCo, două metode de evaluare a structurilor proteice prezise.

O reprezentare completă a modelului structural al proteinei Amb a 4 este prezentată în figura 1A şi în figura 1B, iar pentru proteina Amb a 6, în figurile 1C şi 1D.
 

Predicţia de epitopi pentru limfocite B

După generarea modelelor de structură terţiară pentru Amb a 4 şi Amb a 6, ne-am propus să identificăm epitopi de legare a IgE (epitopi B) pentru aceste alergene.

Primul tip de predicţie pe care l-am realizat a fost pentru epitopi liniari continui.

Pe baza caracteristicilor fizico-chimice ale proteinelor – hidrofilicitatea, sarcinile electropozitive/electronegative şi flexibilitatea structurală – şi a unor algoritmi de inteligenţă artificială antrenaţi pe date publicate cu epitopi cunoscuţi, am prezis următorii epitopi B continui pentru Amb a 4: 5-24, 33-41, 58-75, 88-107, 116-129 (figura 2A). Epitopii B liniari continui prezişi pentru Amb a 6 sunt 19-24 şi 70-76 (figura 3A). Cel de-al doilea tip de predicţie a fost pentru epitopi discontinui şi s-a bazat pe modelele structurale proteice generate anterior. Epitopii B discontinui pentru Amb a 4 şi Amb a 6 sunt prezentaţi în tabelul 1. DiscoTope nu a prezis niciun epitop B discontinuu pentru Amb a 6.

Predicţia de epitopi pentru limfocite T

Secvenţele de nouă aminoacizi în lungime, raportate anterior ca esenţiale pentru legarea la MHC-clasa II (Rammensee, Friede, & Stevanovic, 1995) au fost prezise prin metoda IEDB Consensus 2.2. Pentru Amb a 4 au fost prezise următoarele peptide reprezentând epitopi T cu afinitate puternică de legare (rang ajustat < 10%) la alelele HLA HLA-DQA1*05:01/DQB1*03:01: 74-82, 76-84, 65-73, 46-54 şi 77-85 (figura 2B).

Pentru Amb a 6 au fost prezise următoarele peptide reprezentând epitopi T cu afinitate puternică de legare (rang ajustat < 10%) la alelele HLA-DRB1*03:01/HLA-DRB3*01:01: 59-67, HLA-DRB1*12:01: 52-60 şi HLA-DRB1*07:01: 53-61 (figura 3B).

Discuţie

În acest studiu am propus două modele de structură proteică terţiară a alergenelor Amb a 4 şi Amb a 6 obţinute prin modelarea prin omologie.

Modelele generate au fost utile în special pentru prezicerea epitopilor B discontinui.

Predicţia epitopilor B discontinui este importantă pentru evaluarea tuturor epitopilor B posibili, deoarece se estimează că doar 10% dintre epitopii B sunt liniari şi 90% sunt discontinui (Zhao et al., 2012), astfel că prezicerea doar a epitopilor liniari ar putea duce la pierderea din vedere a multor alţi epitopi-candidat. Epitopii liniari diferă de epitopii discontinui (conformaţionali) prin continuitatea aminoacizilor în secvenţa primară – aminoacizii unui epitop liniar sunt continui în secvenţa primară, în timp ce acei aminoacizi incluşi într-un epitop conformaţional nu sunt continui.

Toţi epitopii B liniari prezişi au o lungime între 5 şi 20 de aminoacizi, care este în intervalul de lungime 5-22 aminoacizi, tipic pentru epitopii liniari pentru limfocite B (Singh et al., 2013).

Epitopii T cu afinitate mare de legare prezişi sunt cei mai adecvaţi candidaţi pentru vaccinurile pe bază de epitopi T (Lin et al., 2008). Cu toate acestea, dezvoltarea unei abordări terapeutice folosind aceste peptide ar putea prezenta limitări în populaţiile cu o frecvenţă scăzută a acestor alele HLA identificate de predicţia noastră.

Epitopii T şi B identificaţi în acest studiu pot servi ca secvenţe-candidat pentru imunoterapia alergen-specifică bazată pe peptide, care oferă promisiunea unei terapii de scurtă durată, eficientă şi sigură pentru a gestiona alergia la ambrozie.

Abordările moleculare pentru AIT cu peptide sintetice cu epitopi T au arătat efecte benefice pentru pacienţii alergici la alergenele de pisică în studiile de expunere la alergene, dar un studiu clinic de fază III nu a reuşit să arate un beneficiu semnificativ clinic (Agache, 2019). Pentru BM32, un vaccin peptidic pe bază de epitopi B, s-au obţinut rezultate foarte bune într-un studiu multicentric de fază IIb în care pacienţii alergici la polenul de graminee au fost trataţi pentru o perioadă de doi ani (Valenta et al., 2017).

BM32 se bazează pe o strategie de design de vaccin dezvoltată recent, care încorporează peptide liniare derivate din epitopi B conformaţionali ai alergenului de interes, fuzionate de proteine carrier nealergenice, care stimulează limfocitele T helper pentru inducerea anticorpilor blocanţi IgG (Zhernov et al., 2019). Avantajele acestui design în comparaţie cu unul bazat pe peptide sintetice scurte derivate din epitopii T ai alergenelor sunt inducerea anticorpilor blocanţi IgG şi evitarea posibilelor reacţii cutanate de fază târzie mediate de epitopii T.

Concluzii

Pentru dezvoltarea viitoare a AIT pe bază de epitopi T şi B, metodele de predicţie a epitopilor in silico ar putea ajuta la reducerea timpului şi costului sintezei peptidelor, în special pentru AIT pe bază de epitopi B, în care se sintetizează peptide suprapuse derivate din întreaga secvenţă a alergenului care apoi sunt evaluate in vitro pentru a identifica epitopii conformaţionali de legare cu IgE. Pe baza rezultatelor predicţiei se pot exclude secvenţe de peptide specifice care conţin predominant epitopi T cu afinitate crescută de legare de MHC clasa II (nedoriţi din pricina posibilelor reacţii adverse de fază târzie) şi astfel se poate reduce numărul de peptide-candidat care vor fi sintetizate. Cu toate acestea, metodele de calcul trebuie să fie complementate de evaluarea in vitro a profilului de siguranţă a peptidelor şi a efectelor imunoreglatoare, precum şi de validarea producerii de anticorpi blocanţi IgG în studii pe animale, înainte de a trece la proiectarea unui prototip de vaccin-candidat.