OBSTETRICĂ

Testarea genetică prenatală neinvazivă prin AND liber fetal - metodă de screening pentru sarcinile cu risc înalt de malformaţii fetale

 Prenatal genetic testing through NIPT - screening method in high risk pregnancies for fetal malformations

First published: 22 mai 2017

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Gine.16.2.2017.762

Abstract

The field of non-invasive prenatal screening and diagnosis appears to be revolutionized by the introduction of cell free fetal DNA-based tests conducted on blood samples collected from pregnant women. Accompanied by the public release of this new method of prenatal screening, 2011-2016 period brought about a variety of studies, concerned with the evaluation of technologies used - singular nu­cleo­tide polymorphism and massive genomic parallel sequen­cing, with the sole purpose of increasing its spe­ci­fi­city and sensitivity. The importance of reviewing the latest studies conducted on non-invasive prenatal tes­ting is enforced by the need of a standardized protocol for the application of the method in the safest way possible. This paper is a review of articles pu­blished worldwide during 2012-2016, obtained after an extensive search of databases such as PubMed, UpToDate, The Cochrane Library, Springer Link.

Keywords
non-invasive prenatal testing, cell free fetal DNA, prenatal screening

Rezumat

Domeniul screeningului şi al diagnosticului genetic prenatal neinvaziv pare a fi revoluţionat de introducerea testării ADN-ului fetal liber din sângele matern. Începând cu 2011, odată cu introducerea în practica clinică a acestei me­to­de de screening prenatal, numeroase studii s-au axat pe cercetarea folosirii tehnicilor de secvenţiere genomică pa­ra­lelă masivă şi polimorfism singular de nucleotide, cu scopul de creştere a specificităţii şi sensibilităţii sale. Ne­ce­sitatea unei lucrări de revizuire a ultimelor studii rea­li­zate pe testarea prenatală neinvazivă prin ADN li­ber fetal este susţinută de nevoia de standardizare a pro­to­coa­lelor de management al acestei metode, pentru o cât mai bună înţelegere şi aplicare a metodei. Lucrarea de fa­ţă reprezintă un review de articole publicate în perioada 2012-2016 la nivel internaţional, rezultate în urma unei cău­tări extensive în cadrul unor baze de date, precum PubMed, UpToDate, The Cochrane Library, Springer Link.

Introducere

Începând cu 2011, o nouă metodă de screening prenatal a fost lansată pe piaţă şi pare a schimba rapid paradigmele testării prenatale. Testarea prenatală neinvazivă (NIPT) oferă un pas intermediar între testul combinat şi metodele de diagnostic invazive. NIPT este bazat pe analiza ADN-ului fetal liber circulant (cffDNA) prezent în sângele matern. La prima vedere, NIPT este mai specific, cu o rată mai mică de rezultate fals-pozitive în comparaţie cu testul combinat, dar nu poate încă să fie introdus în categoria de test diagnostic.

În 1997 a fost prima oară demonstrată prezenţa ADN-ului fetal liber circulant în sângele matern(1), în 2001 s-a determinat prima oară Rh-ul fetal, urmat, în 2006, de sexul fetal. Metoda a fost lansată pe piaţa largă în 2011 şi a cunoscut o creştere exponenţială de la 100000 de teste efectuate în 2012 la 1000000 în 2015.

ADN-ul liber fetal

Sursa primară de ADN fetal liber provine din apoptoza celulelor placentare - sinciţiotrofoblast. Totodată, apoptoza eritrocitelor fetale este şi ea o sursă de ADN liber fetal, acesta putând trece bariera feto-placentară şi ajunge în circulaţia maternă(2). ADN-ul circulant, indiferent de origine, este foarte fragmentat, fiecare fragment având între 50 şi 200 de baze, cu o mărime medie de 146 de baze(3,4).

Tehnicile testării prenatale neinvazive

Aşa cum a fost menţionat mai devreme, cantitatea totală de ADN liber este mică (mai puţin de 1 µg în 20 ml de sânge). Până la momentul actual nu s-a descoperit o metodă fiabilă de separare a ADN-ului liber fetal de cel matern, de aici provenind şi una dintre limitările testului şi probabil diferenţa între metoda de screening şi diagnostic atribuită acestuia(5). Astfel, detectarea anomaliilor din ADN-ul liber se poate realiza doar după amplificarea printr-o reacţie de polimerizare în lanţ (PCR) şi analizarea întregului complement. Există două abordări diferite ale acestui concept: cantitativă (totală sau ţintită) şi calitativă (polimorfism singular de nucleotide - SNP)(6,7).

  • Secvenţierea masivă paralelă cantitativă totală (shotgun) - MPSS

MPSS este o tehnică bazată pe secvenţierea de nouă generaţie (NGS), care analizează toţi cromozomii. Astfel, zeci de milioane de fragmente de ADN sunt secvenţiate rapid şi simultan, acest lucru fiind vital pentru posibilitatea implementării metodei, întrucât cu cât creşte numărul de analizări necesare, cu atât creşte costul(8).

După un prim pas de amplificare şi secvenţiere a complementului de ADN liber fetal şi matern, originea cromozomului este obţinută prin compararea fiecărui fragment cu genomul uman. Următorul pas este compararea densităţii fiecărui cromozom descoperit cu densitatea medie cunoscută a acestuia (analiza scorului z). Un făt trisomic deţine cu 50% mai mult material genetic cu originea în cromozomul afectat, astfel cantitatea descoperită comparată cu cantitatea unui făt euploid o să fie mai mare şi va returna un rezultat pozitiv pentru o sarcină cu risc crescut de aneuploidie(6).

Principalul punct slab al MPSS reiese din însăşi tehnica folosită. Fiind o metodă de numărare şi comparare cantitativă, aceasta este dependentă de fracţia fetală de ADN liber. Vârsta sarcinii şi indicele de masă corporală crescut matern rezultă în fracţii fetale mici şi un număr foarte mare de analizări necesare pentru un rezultat relevant.

  • Secvenţierea masivă paralelă cantitativă ţintită (targeted)

Secvenţierea ţintită generează amplificarea şi secvenţierea selectivă a regiunilor genomice, spre deo­se­bire de MPSS, unde citirile sunt aleatorii din toţi cromozomii. Astfel, rezolvă problema MPSS a necesităţii unui număr foarte mare de analizări, întrucât aproape orice citire returnează un rezultat util(9). Secvenţierea ţintită permite axarea analizei pe cromozomii importanţi clinic, cu precădere 21, 13, 18, X şi Y.

  • Polimorfismul singular de nucleotide (SNP)

Includerea informaţiei genotipice, în general SNP-uri, generează o analiză mult mai complexă a ADN-ului liber fetal, rezultând informaţii mult mai specifice, spre deosebire de metodele cantitative. Secvenţierea bazată pe SNP poate fi definită ca o metodă calitativă de analiză care poate să identifice contribuţia maternă şi fetală a ADN-ului liber(10). Tehnica calitativă oferă, de asemenea, posibilitatea reconstrucţiei haplotipurilor cu identificarea triploidiilor şi permite folosirea de modele sofisticate, capabile de a marca probele care nu deţin suficiente date pentru a returna un rezultat şi necesită o nouă recoltare.

Există până la momentul actual două metode care se bazează pe SNP:

  • Raţia alelelor

Această primă metodă genotipică amplifică şi secvenţiază SNP-uri, numărând alele materne şi fetale şi generând raţia dintre un cromozom de interes şi cromozomul de referinţă(11). Necesitatea unui cromozom de referinţă face ca această metodă să nu poată, la momentul actual, să detecteze triploidii. Ea nu a fost validată de niciun studiu clinic şi nu este încă introdusă pe piaţă.

  • Analiza genotipică

A doua metodă foloseşte amplificarea ţintită a SNP-urilor, urmată de NGS şi o analiză informatică, pentru identificarea sursei cromozomului fetal studiat(12). Poate părea la prima vedere o metodă foarte asemănătoare cu MPSS, dar diferenţele provin din ţintirea nu a unor zone nonpolimorfice, ci a unor SNP-uri, şi astfel metoda este mai mult analitică decât cantitativă.

Datorită faptului că metoda foloseşte o analiză a originii şi cantităţii alelice, aceasta nu necesită un cromozom de referinţă şi nu este supusă variaţiilor datorate amplificării.

Este până la momentul actual cea mai specifică metodă, cu rate de 100% de depistare a aneuploidiilor (trisomia 21,13,18) şi 0% rezultate fals pozitive. Totodată, este singura capabilă să detecteze triploidii(6,19).

Sensibilitatea şi specificitatea testării prenatale neinvazive

În cel mai mare review de literatură şi metaanaliză realizat pe NIPT, publicat în 2016 de BMJ Open, 41, 37 şi 30 de studii au fost introduse bazate pe sindromul Down, respectiv Edwards şi Patau. Sensibilitatea generală a fost calculată la 99,3% (95% - 99,6%) pentru Down, 97,4% (95,8% - 98,4%) pentru Edwards şi 97,4% (86,1% - 99,6%) pentru sindromul Patau. Sensibilitatea a fost mai mică în cazul sarcinilor multiple, redusă cu 9% pentru Down, 28% pentru Edwards şi cu 22% pentru Patau(13). Conform articolului, sensibilitatea a fost mai scăzută pe testările efectuate în primul trimestru, astfel Pergament et al. au descoperit că rata de rezultate neconcludente la mai puţin de 9 săptămâni este de aproximativ 27,4%, între 9 şi 9,6 săptămâni - 12% şi la mai mult de 10 săptămâni de 5,9%(14). Atât Pergament et al., cât şi Norton et al. au concluzionat că prevalenţa aneuploidiilor în grupurile fără rezultat este mai mare decât în cohorta generală (10,9%, în comparaţie cu 0,4%)(14,15,18).

Specificitatea calculată a fost 99,9% (99,9% - 100%) pentru toate trei trisomiile. Aceasta a fost însă mai scăzută în studiile pe sarcini cu risc scăzut de malformaţii fetale, astfel, la un număr de 100000 de testări pe populaţie neselectată anterior, ne aşteptăm la o detecţie prin NIPT a 417, 89 şi 40 de cazuri de Down, Edwards, respectiv Patau, cu 94, 154, respectiv 42 de rezultate fals-pozitive. De aici şi bariera între testul de screening şi testul de diagnostic şi necesitatea reconfirmării oricărui test pozitiv.

Rata de rezultate neconcludente a fost între 0% şi 12,7% şi, din 5789 de sarcini la care s-a refăcut testarea, un număr de 803 (13,9%) au prezentat un rezultat neconcludent şi a doua oară. La calcularea sensibilităţii şi specificităţii bazate şi pe rezultatele neconcludente s-a observat o scădere a sensibilităţii cu 1,7% pentru sindromul Down, 1,6% pentru Edwards şi 7,1% pentru Patau(13).

Acurateţea testului nu a fost influenţată de tehnica de testare folosită (MPSS sau SNP).

Indicaţiile testării prenatale neinvazive

În septembrie 2015, Colegiul American de Obstetrică-Ginecologie (ACOG) a formulat o serie de indicaţii şi recomandări cu privire la NIPT, venind astfel în sprijinul medicilor pentru o mai bună informare a pacientelor şi o folosire adecvată a acestei noi metode de screening prenatal.

Tabelul 1. Comparaţie între principalele teste neinvazive
Tabelul 1. Comparaţie între principalele teste neinvazive
  • NIPT este validat clinic şi recomandat ca metodă principală de screening doar pentru sarcinile cu risc crescut, acestea fiind definite de ACOG ca:

1. vârsta maternă de 35 ani sau peste la naşterea fătului;

2. modificări ecografice relevante pentru o aneuploidie;

3. antecedente personale de sarcină cu malformaţii fetale;

4. screening pozitiv pentru aneuploidie (dublu, triplu test);

5. existenţa pe analiza genetică a părinţilor a unei translocaţii robertsoniene cu risc crescut pentru trisomie 21 sau 13.

  • NIPT nu trebuie folosit ca o metodă de elecţie pentru studiul microdeleţiilor.
  • NIPT nu este recomandat la sarcinile multiple.
  • Orice rezultat pozitiv trebuie verificat printr-o metodă de diagnostic, astfel încât nicio indicaţie de întrerupere a sarcinii nu va fi formulată fără o verificare prealabilă.
  • Orice testare care nu produce un răspuns sau acesta este nedeterminat ori neinterpretabil trebuie tratată ca un răspuns de risc crescut, iar pacienta trebuie să primească consiliere şi îndrumare spre o metodă de diagnostic.
  • Pacientelor trebuie să li se prezinte beneficiile, riscurile şi limitările metodei(16).

Limitările testării prenatale neinvazive

Utilizarea clinică a NIPT pentru screeningul mal­for­ma­ţiilor fetale devine rapid o metodă larg apreciată şi folosită. Totuşi, metoda este, ca urmare a limitărilor pe care le prezintă, considerată încă o metodă de screening, cu necesitatea îmbunătăţirii tehnicilor de testare şi a reducerii de costuri până la posibilitatea transformării în metodă de diagnostic.

  • NIPT nu prezintă aceeaşi sensibilitate pentru sarcinile multiple, din cauza imposibilităţii de selectare eficientă a originii ADN-ului.
  • NIPT este dependent de fracţia fetală, cantitatea de ADN liber fetal din totalul de ADN liber. Fracţia fetală este cuprinsă, în general, între 1% şi 13%, necesarul minim pentru testare fiind de 4%. Vârsta mică a sarcinii şi greutatea mare a mamei sunt principalele cauze pentru o fracţie fetală scăzută şi deci un risc mai mare de rezultat neconcludent.
  • NIPT a fost validat clinic extins pe populaţiile cu risc crescut de malformaţie fetală. În literatura de specialitate există însă foarte puţine articole pe cohorte de populaţie generală sau cu risc scăzut (studii cuprinzând între 289 şi 2049 de paciente), făcând astfel imposibilă calcularea unor sensibilităţi şi specificităţi reale.
  • NIPT nu poate, la momentul actual, să redea un rezultat specific pe o anumită aneuploidie. Rezultatele sunt prezentate ca pozitiv/negativ sau ca risc de malformaţie - <1/10000 sau >99%. Totodată, originea aneuploidiei nu poate fi precizată. De exemplu, NIPT nu poate determina dacă sindromul Down este datorat prezenţei unui extracromozom, a unei translocaţii robertsoniene sau a unui mozaicism înalt. Identificarea mecanismului de producere a aneuploidiei este importantă pentru consilierea genetică şi riscul de recurenţă.
  • NIPT prevede un cariotip matern normal, deoarece un mozaicism matern sau prezenţa unei tumori solide materne poate influenţa rezultatul(17)
Tabelul 2. Principalele diferenţe şi asemănări între testarea prenatală neinvazivă şi metodele tradiţionale de screening
Tabelul 2. Principalele diferenţe şi asemănări între testarea prenatală neinvazivă şi metodele tradiţionale de screening

Bibliografie

1. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997;350:485–7.
2. Sekizawa A, Samura O, Zhen DK, et al. Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood. Prenat Diagn 2000; 20:886.
3. Chan KC, Zhang J, Hui AB, et al. Size distributions of maternal and fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem 2004; 50:88.
4. Yu SC, Chan KC, Zheng YW, Jiang P, Liao GJ, Sun H, et al. Sizebased molecular diagnostics using plasma DNA for non-invasive prenatal testing. Proc Natl Acad Sci USA 2014;111:8583–8.
5. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, Song K, Oliphant A. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:319.
6. Levy B, Norwitz E. Non-invasive prenatal aneuploidy testing: technologies and clinical implication. MLO Med Lab Obs 2013;45:8,10,12.
7. Nepomnyashchaya YN, Artemov AV, Roumiantsev SA, Roumyantsev AG, Zhavoronkov A. Non-invasive prenatal diagnostics of aneuploidy using next-generation DNA sequencing technologies, and clinical considerations. Clin Chem Lab Med 2013;51:1141–54.
8. Boon EM, Faas BH. Benefits and limitations of whole genome versus targeted approaches for non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidies. Prenat Diagn 2013;33:563–8.
9. Sparks AB, Wang ET, Struble CA, Barrett W, Stokowski R, McBride C, et al. Selective analysis of cell-free DNA in maternal blood for evaluation of fetal trisomy. Prenat Diagn 2012;32:3–9.
10. Liao GJ, Chan KC, Jiang P, Sun H, Leung TY, Chiu RW, et al. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 21 by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA. PLoS One 2012;7:e38154.
11. Liao GJ, Lun FM, Zheng YW, Chan KC, Leung TY, Lau TK, et al. Targeted massively parallel sequencing of maternal plasma DNA permits efficient and unbiased detection of fetal alleles. Clin Chem 2011;57:92–101.
12. Zimmermann B, Hill M, Gemelos G, Demko Z, Banjevic M, Baner J, et al. Non-invasive prenatal aneuploidy testing of chromosomes 13, 18, 21, X, and Y, using targeted sequencing of polymorphic loci. Prenat Diagn 2012;32:1233–41.
13. Sian Taylor-Phillips, Karoline Freeman, Julia Geppert, Adeola Agbebiyi, Olalekan A Uthman, Jason Madan, Angus Clarke, Siobhan Quenby, Aileen Clarke. Accuracy of non-invasive prenatal testing using cell-free DNA for detection of Down, Edwards and Patau syndromes: a systematic review and meta-analysis.BMJ Open 2016;6:1 e010002.
14. Pergament E, Cuckle H, Zimmermann B, et al. Single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal screening in a high-risk and low-risk cohort. Obstet Gynecol 2014;124(2 Pt 1):210–18.
15. Norton ME, Jacobsson B, Swamy GK, et al. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med 2015;372:1589–97.
16. Cell-free DNA screening for fetal aneuploidy. Committee Opinion No. 640. American College of Obstetricians and Gynecologists. Obstet Gynecol 2015;126:e31-7.
17. Lutgendorf MA, Stoll KA, Knutzen DM, Foglia LM. Non-invasive prenatal testing: limitations and unanswered questions. Genet Med 2014;16:281–5.
18. Roşca I, Ristea A, Şerban M, Tocariu R, Tudor V, Nanea M, Mitran M. Congenital heart disease in Cornelia de Lange syndrome. Case report. Revista Ginecologia.ro, 2015;3(9):56-60.
19. Comănescu CA, Cernea N, Siminel M, Comănescu MC, Barbu M, Comănescu MV. Prenatal diagnosis of Jarcho-Levin syndrome. Revista Ginecologia.ro, 2015;3(10):18-9.

Articole din ediţiile anterioare

OBSTETRICĂ | Ediţia 21 (3) / 2018

Testarea prenatală – studiu despre cunoaşterea şi atitudinea pacientelor

Viorica Tudor, Octavia Velicu, Roberta Ciobanu, Dinu-Florin Albu, Mihai Mitran, Emilia Severin

Într-o eră a tehnologiei în plină dezvoltare, in­for­marea a devenit foarte uşor accesibilă. Totuşi, pacientele gra­vi­de prezintă lacune important...

28 septembrie 2018