SINTEZE

O scurtă istorie a descoperirii antibioticelor şi a evoluţiei rezistenţei la antibacteriene

 A short history of antibiotics discovery and the evolution of antimicrobial resistance

Vasilica Ungureanu

First published: 31 octombrie 2018

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Inf.55.3.2018.2032

Abstract

Antibiotics, the revolutionary discovery of the 20th century, are still the main tool in the fight against bacterial infections. Unfortunately, their use has been accompanied by the rapid emergence of resistant bacterial strains, becoming an important public health problem worldwide. In the 1930s, when antibiotics era began, the first antibacterial substances – sulfonamides and penicillin – were discovered. Between 1940 and 1960, most of the antibiotics currently used were discovered, followed by the 1980-1990 period when genetic studies of bacterial genome and antibiotic action mechanisms were carried out. The most important classes of antibiotics and their mechanisms of action are characterized. Very soon, after the discovery of the first antibiotics, the antibiotic resistance phenomenon is recognized, one of the first three important threats of public health in the 20th century. The increasing occurrence and isolation of so-called superbacteria with a high level of resistance to most antibiotic classes pose serious problems for the treatment of bacterial infections. Knowing the mechanisms and genetic bases of resistance to the main classes of antibiotics can give us information on taking measures to prevent and slow the spread of resistance.

Keywords
antimicrobial resistance, surveillance, public health

Rezumat

Antibioticele, descoperirea revoluţionară a secolului XX, reprezintă în continuare principalul instrument în lupta împotriva infecţiilor bacteriene. Din nefericire, utilizarea lor a fost însoţită de apariţia rapidă a tulpinilor bacteriene rezistente, devenind o importantă problemă de sănătate publică pe plan mondial. În anii 1930, când începe era antibiotică, sunt descoperite primele substanţe cu efect antibacterian – sulfonamidele şi penicilina. În perioada 1940-1960 sunt descoperite cele mai multe dintre antibioticele utilizate în prezent, urmând apoi perioada anilor 1980-1990, când au fost realizate studii genetice pentru cunoaşterea genomului bacterian, precum şi a mecanismelor de acţiune a antibioticelor. Sunt caracterizate cele mai importante clase de antibiotice şi mecanismele lor de acţiune. Foarte curând, după descoperirea primelor antibiotice, este recunoscut fenomenul de rezistenţă la antibiotice, una dintre primele trei ameninţări importante ale secolului XX la adresa sănătăţii publice. Apariţia şi izolarea tot mai frecventă a aşa-ziselor superbacterii, cu un nivel ridicat de rezistenţă la majoritatea claselor de antibiotice, pun probleme serioase de terapie a infecţiilor bacteriene. Cunoaşterea mecanismelor şi bazelor genetice ale rezistenţei la principalele clase de antibiotice ne poate da informaţii privind luarea de măsuri pentru prevenirea şi încetinirea răspândirii rezistenţei.

Introducere

Descoperirea şi introducerea antibioticelor în secolul XX au revoluţionat medicina în multe privinţe şi au salvat nenumărate vieţi, ceea ce a reprezentat un punct de cotitură în istoria omenirii. Antibioticele rămân unul dintre cele mai importante instrumente farmacologice pentru controlul bolilor infecţioase. De asemenea, antibioticele sunt utilizate pe scară largă, ca agenţi terapeutici sau profilactici, în practicile agricole. Din nefericire, utilizarea acestor medicamente minunate a fost însoţită de apariţia rapidă a tulpinilor bacteriene rezistente şi de erodarea utilităţii clinice.

Rezistenţa antimicrobiană este una dintre cele mai grave ameninţări la adresa sănătăţii umane, unii agenţi patogeni devenind rezistenţi la mai multe clase de antibiotice (multidrug resistant = MDR). În momentul actual se exprimă marea îngrijorare a revenirii la epoca preantibiotică. În SUA, CDC estimează că aproximativ două milioane de persoane sunt infectate cu bacterii care nu pot fi tratate cu antibiotice şi cel puţin 23000 de persoane mor anual din cauza acestor infecţii(1). Pe tot globul se înregistrează acum aproximativ 700000 de decese în fiecare an cauzate de infecţii cu aceşti microbi rezistenţi la antibiotice. Potrivit unui studiu riguros comandat de guvernul britanic, această cifră ar putea creşte la 10 milioane, depăşind la nivel mondial chiar şi decesele cauzate de cancer.

Nevoia de noi terapii cu antibiotice este acută şi creşte în mare parte din cauza apariţiei agenţilor patogeni rezistenţi la medicamente. Sunt enumerate în secvenţele genomului bacterian peste 20000 de gene de rezistenţă (gene r), de aproape 400 de tipuri diferite. Dovezile susţin existenţa unui rezistom bacterian mare (totalitatea genelor de rezistenţă şi a precursorilor lor atât în bacteriile patogene, cât şi în cele nepatogene)(2). Indiferent de originea lor, genele de rezistenţă se pot deplasa rapid prin populaţiile bacteriene şi pot apărea în bacteriile patogene. Înţelegerea proceselor care contribuie la evoluţia şi selectarea rezistenţei este esenţială pentru gestionarea stocurilor actuale de antibiotice şi pentru dezvoltarea unora noi.

Această problemă serioasă este recunoscută pe plan internaţional. În ciuda numeroaselor rapoarte şi recomandări emise de diversele agenţii internaţionale şi naţionale, dezvoltarea rezistenţei la antibiotice continuă. Se impun o serie de acţiuni agresive pentru a împiedica apariţia de noi rezistenţe şi pentru a preveni răspândirea rezistenţelor deja existente.

Descoperirea antibioticelor şi mecanisme de acţiune

Înainte de anii 1930 este descrisă perioada preantibiotică, numită şi epoca întunecată, când mortalitatea prin infecţii era uriaşă.

Era antibiotică a adus terapii adecvate pentru infecţii bacteriene şi a început cu introducerea sulfonamidelor, în 1935 (descoperite anterior de Domagk), şi a penicilinelor, în cursul celui de-al Doilea Război Mondial (descoperite anterior de Fleming)(3,4).

După cum se ştie, primul compus antimicrobian – penicilina – a fost descoperit de Alexander Fleming în 1928, când a observat că ciuperca Penicillinium notatum a distrus coloniile de S. aureus(5). Însă aceasta a fost introdusă în terapia infecţiilor abia în 1942, când farmacologul Howard Florey şi biochimistul Ernst Boris Chain au purificat şi au produs pe scară largă penicilina – considerată medicamentul-miracol al secolului XX.

Anii 1940-1960 sunt anii de glorie, când au fost descoperite cele mai multe dintre antibioticele utilizate în prezent. În anii 1980-1990 au fost conduse studii genetice pentru cunoaşterea genomului bacterian, a ţintelor de la nivelul bacteriilor asupra cărora acţionează antibioticele.

În prezent sunt cunoscute numeroase clase de agenţi antimicrobieni, clasificate pe baza mecanismelor lor de acţiune(6). Astfel, antibioticele pot acţiona împotriva agenţilor bacterieni prin diverse mecanisme, precum: i) inhibarea sintezei proteinelor (ex.: aminoglicozidele, cloramfenicolul, macrolidele, streptomicina şi tetraciclinele); ii) interacţiunea cu sinteza ADN‑ului şi ARN‑ului (ex.: chinolonele şi rifampicina); iii) inhibarea sintezei sau distrugerea peretelui celular bacterian (ex.: β-lactaminele şi glicopeptidele); iv) modificarea metabolismului energetic al celulei microbiene (ex.: sulfonamidele şi trimetoprimul).

O scurtă istorie a celor mai importante clase de antibiotice

Aminoglicozidele au fost descoperite în urmă cu peste 70 de ani(7). La începutul anilor 1940 a fost descoperit primul aminoglicozid – streptomicina –, din Streptomyces griseus(8). În 1949 şi 1957, neomicina şi, respectiv, kanamicina au fost izolate din alte specii de Streptomyces, iar în anii 1960 a fost descoperită gentamicina – din Micromonospora purpurea. Primele derivate semisintetice au fost descoperite şi caracterizate în anii 1970 (netilmicina – derivată din sisomicină – şi amikacina – derivată din kanamicină)(7). Aminoglicozidele sunt agenţi antimicrobieni cu spectru larg, care inhibă sinteza proteinelor şi/sau alterează integritatea membranelor celulare bacteriene.

Beta-lactaminele. În ultimii 30 de ani au fost dezvoltate noi antibiotice β-lactamice. Familia β-lactaminelor include peniciline şi derivaţi, cefalosporine, carbapeneme, monobactame, inhibitori ai β-lactamazei(9).

Compusul de bază al penicilinei, acidul 6-aminopenicilanic, este utilizat ca punct de plecare principal pentru prepararea numeroşilor derivaţi semisintetici. Deşi cefalosporinele sunt adesea considerate derivate noi şi îmbunătăţite ale penicilinei, ele au fost descoperite ca substanţe care apar în mod natural. Acestea pot fi grupate în cefalosporine de generaţia I, a II-a, a III-a şi a IV-a, în funcţie de spectrul lor de activitate şi de momentul introducerii agentului în terapia antimicrobiană. În general, cefalosporinele din prima generaţie au o bună activitate pe bacteriile Gram-pozitive şi o acoperire modestă a microorganismelor Gram-negative; a II-a generaţie de cefalosporine are o activitate bună asupra germenilor Gram-negativi şi oarecum mai puţin bună asupra florei Gram-pozitive; cefalosporinele de a III-a generaţie au o activitate îmbunătăţită asupra germenilor Gram-negativi şi variabilă asupra germenilor Gram-pozitivi; iar a IV-a generaţie prezintă o activitate cu spectru larg, cefalosporinele fiind active atât pe Gram-negativi, cât şi Gram-pozitivi.

Carbapenemele (imipenem şi meropenem) difuzează cu uşurinţă în celula bacteriană, fiind considerate antibiotice β-lactamice cu spectru larg de acţiune.

Inhibitorii β-lactamazei, cum ar fi acidul clavulanic, nu conţin inelul β-lactamic, însă prezintă activitate antimicrobiană neglijabilă şi sunt utilizaţi în combinaţie cu antibiotice β-lactamice pentru a depăşi rezistenţa bacteriilor care secretă β-lactamază, care altfel ar inactiva majoritatea penicilinelor.

Antibioticele β-lactamice inhibă sinteza peretelui celular prin legarea lor la proteinele membranei citoplasmatice – proteinele care leagă penicilinele (PLP), acestea fiind ţintele β-lactaminelor. Aceste PLP sunt de fapt enzime (transpeptidazele, carboxipeptidazele şi transglicozilazele) implicate în sinteza peptidoglicanului; prin legarea la PLP, β-lactaminele inhibă transpeptidarea peretelui celulei bacteriene, ceea ce duce la formarea unui peptidoglican subţire, urmat de liza şi moartea celulei ca urmare a presiunii(10).

În ceea ce priveşte penicilina (unul dintre cele mai vechi antibiotice), este important de semnalat că este încă activă faţă de multe bacterii; este în continuare antibioticul de elecţie pentru infecţiile cauzate de Streptococcus pyogenes (streptococul β-hemolitic de grup A = SGA), până în momentul actual nefiind detectată nicio tulpină de SGA rezistentă la penicilină(11). Tulpinile de Streptococcus pneumoniae au câştigat rezistenţă faţă de penicilină într-o proporţie variabilă, în funcţie de regiunea geografică(12). Însă un semnal de alarmă trebuie tras asupra diagnosticului fals, în cea mai mare proporţie, de alergie la penicilină, în special la copii(13).

Dintre glicopeptide, vancomicina a fost izolată ca produs de fermentaţie de la o bacterie din sol, Streptomyces orientalis, care prezintă activitate antimicrobiană, fiind introdusă în terapia antimicrobiană la sfârşitul anilor 1950(14). Aproape 30 de ani mai târziu a urmat un alt antibiotic glicopeptidic, teicoplanina(15).

Glicopeptidele se fixează pe partea peptidică a peptidoglicanului, legându-se de dipeptidul terminal d‑alanil-d-alanină (d-Ala-d-Ala) – ţinta moleculară a acestor antibiotice. După ce glicopeptidele sunt legate de această ţintă, ele împiedică funcţionarea normală a transpeptidazelor şi a transglicozilazelor, antrenând oprirea sintezei peptidoglicanului, ducând la moartea celulei bacteriene(16).

Din clasa macrolidelor, eritromicina A a fost descoperită la începutul anilor 1950. Principala componentă structurală a acestei molecule este un inel lactonic legat prin legături glicozidice de structuri zaharidice şi/sau aminozaharidice. Pentru a depăşi limitările eritromicinei, cum ar fi instabilitatea chimică, absorbţia slabă şi gustul amar, au fost dezvoltate şi alte macrolide, care au inelul lactonic cu 14, 15 şi 16 atomi de carbon, cum ar fi claritromicina şi azitromicina(17).

Macrolidele au un mod similar de acţiune antibacteriană cu al altor două clase de antibiotice: lincosamidele şi streptograminele B. În consecinţă, aceste antibiotice, deşi distincte din punct de vedere chimic, au fost grupate împreună ca antibiotice Macrolide-Lincosamide-Streptogramine B (MLS). Macrolidele, lincosamidele şi streptograminele B inhibă sinteza proteinelor prin legarea la subunitatea ribozomală 50S a bacteriilor(17). În prezent, această clasă de antibiotice s-a extins datorită dezvoltării unor medicamente sintetice. Astfel, ketolidele şi oxazolidinonele pot fi grupate împreună cu agenţii antimicrobieni MLS, rezultând familia de antibiotice MLSKO(18).

Descoperirea chinolonelor. În 1962, în timpul procesului de sinteză şi purificare a clorochinei (un agent antimalaric), a fost descoperit un derivat de chinolonă, acidul nalidixic, cu activitate bactericidă împotriva germenilor Gram-negativi(19). Chinolonele de generaţia a II-a s-au dezvoltat prin adăugarea unui atom de fluor în poziţia 6 a unei molecule de chinolonă, creând o fluorochinolonă, şi a îmbunătăţit considerabil activitatea biologică. În anii 1980 s-au dezvoltat diferite fluorochinolone, de exemplu ciprofloxacin, norfloxacin şi ofloxacin. Aceste fluorochinolone au demonstrat un spectru antimicrobian extins, incluzând şi unii germeni Gram-pozitivi. În decursul anilor 1990 au fost dezvoltate fluorochinolonele de generaţia a III-a, levofloxacin şi sparfloxacin, care prezintă o activitate puternică atât împotriva microbilor Gram-negativi, cât şi a celor Gram-pozitivi. Chinolonele inhibă acţiunea ADN-girazei şi a topoizomerazei IV, două enzime esenţiale pentru replicarea ADN-ului bacterian şi, ca urmare, microbii sunt ucişi(20,21).

Sulfonamidele aparţin celor mai vechi medicamente sintetice introduse. Ele au fost folosite prima dată în 1935(22). Dintre sulfonamide, cel mai frecvent utilizat în zilele noastre este sulfametoxazolul. Din 1968 a fost utilizată pe scară largă combinaţia dintre trimetoprim şi sulfametoxazol (denumită şi cotrimoxazol); această combinaţie, la anumite concentraţii, are un efect sinergic bactericid, reduce selecţia rezistenţei la aceste medicamente, precum şi costurile asociate. Sulfonamidele interferează cu procesul de sinteză al acidului folic, datorită asemănărilor structurale cu acidul paraaminobenzoic, pe care îl antagonizează competitiv(17). Sulfonamidele sunt active pe mai mulţi germeni Gram-pozitivi şi Gram-negativi şi protozoare, însă efectele adverse, alergia şi introducerea de noi antibiotice au redus utilizarea lor. Trimetoprim/sulfametoxazol a reprezentat o renaştere în cadrul terapiei antimicrobiene, datorită faptului că este un tratament de primă linie pentru S. aureus rezistent la meticilină (MRSA), însă trebuie folosit cu atenţie la vârstnici, din cauza riscului pentru hiperkalemie(23).

Dintre tetracicline, clortetraciclina a fost prima izolată în 1948 din Streptomyces aureofaciens. În deceniile următoare au mai fost izolate oxitetraciclina şi tetraciclina din alte specii de Streptomyces; de asemenea, au fost dezvoltate tetracicline semisintetice: doxiciclina, minociclina. Tetraciclinele au constituit primul grup major de antibiotice la care s-a utilizat termenul antibiotice cu spectru larg. Datorită spectrului larg de activitate, siguranţei relative şi costului redus, tetraciclinele au fost utilizate pe scară largă în toată lumea, ocupând locul al doilea în consumul mondial după penicilină. Mecanismul de acţiune este bacteriostatic – tetraciclinele se leagă specific la subunităţile ribozomale 30S, cu împiedicarea sintezei proteice bacteriene. Deşi continuă să fie prescrise pentru tratamentul infecţiilor cauzate de Chlamydia, spirochete, antrax, ciumă, tularemie şi alte infecţii(24), răspândirea utilizării, în special în medicina veterinară, a condus la creşterea ratei de rezistenţă(25). Cercetări recente s-au concentrat pe proprietăţile antiinflamatoare ale tetraciclinelor, în particular minociclina, şi potenţialul neuroprotector faţă de boala Alzheimer, accidentul vascular cerebral şi dezordini neuromusculare(26).

Rezistenţa la antibiotice şi evoluţia acesteia

Organizaţia Mondială a Sănătăţii a numit rezistenţa la antibiotice ca fiind una dintre cele mai importante trei ameninţări la adresa sănătăţii publice ale secolului XX(27). După cum am văzut, această ameninţare este, în mare parte, indusă de om.

Creşterea rezistenţei la medicamentele antimicrobiene este cauza a aproximativ 25000 de decese anual în UE, a afirmat comisarul european pentru sănătate şi siguranţă alimentară, Vytenis Andriukaitis: Este o problemă globală, care are nevoie de o soluţie la scară globală. Din păcate, acumularea de factori – în special utilizarea excesivă şi inadecvată a antibioticelor şi practicile slabe de control al infecţiilor – a transformat progresiv rezistenţa antimicrobiană într-o ameninţare masivă pentru omenire. Creşterea rezistenţei şi lipsa măsurilor de prevenire pot determina o revenire la era preantibiotică, când oamenii au murit din cauza unor infecţii comune şi a unor leziuni minore. Acest lucru ar avea consecinţe majore asupra sănătăţii oamenilor şi asupra economiei, nu numai în Europa, ci şi în întreaga lume(28,29).

De menţionat faptul că rezistenţa antimicrobiană este un fenomen natural, care precede presiunea selectivă modernă a utilizării clinice a antibioticelor. Antibioticele, înainte de a fi folosite ca medicamente, erau produse naturale, fiind substanţe preparate de ciuperci, alge şi bacterii pentru apărare. Această lume microbiană şi-a dezvoltat şi gene care contracarează acţiunea antibioticelor. Astfel, o analiză a bacteriilor vechi de aproximativ 30000 de ani, ale căror ADN-uri au fost recuperate din permafrostul Yukon – Canada, arată că acestea au fost capabile să reziste la antibiotice (prin analiza metagenomică a acestor ADN-uri microbiene vechi s-a identificat o colecţie foarte diversă de gene care codifică rezistenţa la antibiotice β-lactamice, tetracicline şi glicopeptide), dovedindu‑se faptul că rezistenţa antibacteriană este un fenomen vechi, încă dinainte de utilizarea antibioticelor în terapia infecţiilor(30).

În cei peste 70 de ani de la introducerea primelor antibiotice, producţia a fost îmbunătăţită prin crearea unei mari varietăţi de compuşi din ce în ce mai puţin costisitori, care au încurajat utilizarea fără prescripţie sau utilizarea pentru o altă stare patologică decât cea pentru care a fost aprobată oficial. Acest fapt a contribuit semnificativ la selecţia tulpinilor rezistente. Dezvoltarea generaţiilor de microbi rezistenţi la antibiotice şi distribuţia lor în populaţiile microbiene din întreaga biosferă sunt rezultatele multor ani de presiune de selecţie neîncetată de la introducerea antibioticelor, prin utilizare necorespunzătoare, exces de utilizare şi abuz. Antibioticele sunt, de asemenea, utilizate în exces în agricultură – nu doar pentru a combate nişte infecţii, ci şi pentru a stimula creşterea unor animale, cum ar fi puii, porcii şi bovinele, pentru a produce mai multă carne(31). Un studiu realizat în Center for Outcomes Research and Evaluation in Charlotte, North Carolina, a evidenţiat şi un alt aspect al prescrierii neadecvate a antibioticelor la pacienţii din ambulatoriu cu afecţiuni uşoare ale tractului respirator superior: volumul antibioticelor utilizate în ambulatoriu este mult mai mare decât la pacienţii internaţi în spital, până la 30% dintre toate prescripţiile antibiotice ambulatorii fiind considerate inutile şi până la 50%, inadecvate pentru condiţia patologică(32).

Astfel, circulaţia crescută a antibioticelor, atât la oameni, cât şi la animale, a determinat apariţia unor mutaţii la nivelul genomului bacterian, mutaţii care au dus la câştigarea rezistenţei la antibiotice, pentru aceasta fiind responsabilă o gamă largă de mecanisme biochimice şi fiziologice.

De la introducerea în 1935 a primelor antimicrobiene – şi, anume, sulfonamidele – dezvoltarea unor mecanisme specifice de rezistenţă a afectat utilizarea lor terapeutică. Rezistenţa la sulfonamidă a fost raportată iniţial la sfârşitul anilor 1930, aceleaşi mecanisme funcţionând şi după 70 de ani.

În 1940, câţiva ani înainte de introducerea penicilinei ca agent terapeutic, doi membri ai echipei de descoperire a penicilinei au identificat o penicilinază bacteriană(33). Odată cu utilizarea pe scară largă a penicilinei, tulpinile bacteriene rezistente, capabile să inactiveze medicamentul, au devenit prevalente. S-au efectuat studii pentru a modifica chimic penicilina în scopul prevenirii scindării de către penicilinaze (β-lactamaze). În lumina recentelor descoperiri, un număr mare de gene r faţă de antibiotice sunt componente naturale ale populaţiilor microbiene, ceea ce susţine existenţa unei penicilinaze bacteriene înainte de utilizarea antibioticului.

Deja, la jumătatea anilor 1950, în Japonia fusese identificată şi descrisă rezistenţa la antibiotice transferabilă genetic (iniţial întâmpinată cu scepticism în Vest)(34).

Încă din anii 1960, s-a observat creşterea rezistenţei la antibiotice. Astfel, au fost realizate cercetări farmacologice şi biochimice ale antibioticelor pentru cunoaşterea mecanismelor de acţiune, dar şi a mecanismelor de rezistenţă ale acestora, în scopul îmbunătăţirii utilizării antibioticelor prin dozare şi administrare; totodată, au fost realizate studii de modificare chimică a acestora pentru evitarea rezistenţei antimicrobiene.

După administrarea de antibiotice, mulţi dintre agenţii patogeni bacterieni, care au cauzat epidemii în rândul populaţiei umane, au evoluat la forme rezistente faţă de mai multe clase de antibiotice (MDR= multidrug resistant). De exemplu, Mycobacterium tuberculosis MDR este un patogen major care circulă atât în ţările în curs de dezvoltare, cât şi în cele industrializate. Alte infecţii grave includ infecţiile nosocomiale cauzate de Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Citrobacter freundii, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Serratia spp., Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia şi Streptococcus pneumoniae.

Tot mai frecvent este utilizat termenul superbugs (superbacterii), care se referă la agenţii microbieni care cauzează, ca urmare a mutaţiilor multiple, morbiditate şi mortalitate crescute şi determină un nivel ridicat de rezistenţă la clasele de antibiotice recomandate în mod special pentru tratamentul acestora. Opţiunile terapeutice pentru aceşti microbi sunt reduse, cu perioade lungi de îngrijire în spital şi foarte costisitoare. În unele cazuri, tulpinile superrezistente au obţinut, de asemenea, o virulenţă crescută şi o transmisibilitate sporită, ceea ce poate permite ca rezistenţa la antibiotice să fie considerată chiar un factor de virulenţă.

Mecanisme de rezistenţă

Inhibarea creşterii bacteriene de către un antibiotic este realizată când antibioticul interacţionează eficient cu ţinta sa. Pentru ca această interacţiune să aibă loc, există două elemente relevante: i) antibioticul trebuie să recunoască ţinta şi ii) concentraţia antibioticului la nivelul ţintei trebuie să fie suficientă pentru a obţine o inhibare eficientă a activităţii sale. Putem spune că toate mecanismele de rezistenţă se bazează pe: i) modificarea ţintei sau ii) reducerea concentraţiei de antibiotic liber care poate accesa ţinta – fie datorită modificării sale prin enzime de inactivare a antibioticelor, fie prin eliminarea acestuia din celula bacteriană prin intermediul pompelor de eflux. Aceste mecanisme pot fi considerate mecanisme active de rezistenţă. Pe de altă parte, sunt descrise mecanisme care nu afectează antibioticul activ în sine şi pot fi considerate mecanisme pasive de rezistenţă, precum mutaţiile la nivelul genelor care codifică transportorii, ţintele sau proteinele care activează preantibioticul. În plus faţă de aceşti determinanţi clasici ai rezistenţei la antibiotice, lucrări recente au arătat că mai multe elemente, implicate în procesele de bază ale metabolismului bacterian, pot modula răspunsul la antimicrobiene, cum ar fi, de exemplu, producerea de biofilm(35).

Astfel, bacteriile au devenit rezistente la antibiotice prin diverse mecanisme, cum ar fi:

Schimbarea permeabilităţii peretelui celulei bacteriene cu restricţionarea accesului antibioticelor la nivelul situsurilor-ţintă. Exemplu: bacteriile Gram-negative au o membrană exterioară care le protejează şi pe care o pot utiliza pentru a restricţiona selectiv pătrunderea antibioticelor.

Eflux activ al antibioticelor din celula microbiană – bacteriile rezistente pot folosi pompele din pereţii celulelor lor pentru a elimina antibioticele care intră în celulă. Exemplu: Pseudomonas aeruginosa poate produce pompe pentru a elimina mai multe antibiotice importante, inclusiv fluorochinolone, β-lactamine, cloramfenicol şi trimetoprim.

Modificarea/inactivarea enzimatică a antibioticului – unele bacterii rezistente utilizează enzime pentru a modifica antibioticele, astfel încât acestea să îşi piardă eficacitatea. Exemplu: Staphylococcus aureus modifică enzimatic aminoglicozidele prin adăugarea unor compuşi, schimbându-le astfel funcţia.

Degradarea agentului antimicrobian – unele bacterii rezistente utilizează enzime pentru a descompune antibioticul şi a-l face ineficient. Exemplu: Klebsiella pneumoniae produce enzime numite carbapenemaze, care descompun carbapenemele şi majoritatea β-lactaminelor.

Achiziţionarea de căi metabolice alternative pentru a evita acţiunea inhibitorie a antibioticului – unele bacterii rezistente au dezvoltat diferite şi noi procese pentru a evita acţiunea antibioticului. Exemplu: Staphylococcus aureus poate ocoli efectele trimetoprimului.

Modificarea ţintelor specifice antibioticelor – bacteriile rezistente pot modifica ţintele, astfel încât antibioticul să nu le recunoască şi să nu se poată lega la acestea, permiţând bacteriilor să supravieţuiască. Exemplu: Streptococcus pneumoniae îşi schimbă proteinele de legare a penicilinei (PLP), împiedicând ataşarea penicilinei la celula bacteriană şi distrugerea acesteia de către antibiotic.

Studiind diferitele clase de antibiotice, au fost recunoscute mecanisme variate de rezistenţă, specifice acestora:

Rezistenţa la aminoglicozide(36,37,38). Au fost recunoscute mai multe mecanisme de rezistenţă la aminoglicozide: i) efluxul activ, ii) permeabilitatea scăzută a peretelui celulei bacteriene, iii) alterarea ribozomului, iv) inactivarea medicamentelor de către enzimele care modifică aminoglicozidele. Inactivarea prin modificarea enzimatică este mecanismul cel mai răspândit de rezistenţă la antibioticele aminoglicozidice. Creşterea şi difuzarea enzimelor care modifică aminoglicozidele (nucleotidiltransferaze, fosfotransferaze sau acetiltransferaze) au redus eficacitatea acestor antibiotice şi, în unele cazuri, le-au făcut practic inutilizabile. Numărul mare şi capacitatea de a evolua a genelor care codifică aceste enzime, precum şi numeroasele elemente mobile în care sunt localizate rezultă într-o adaptabilitate ridicată a acestor enzime de a utiliza noi antibiotice ca substraturi şi de a difuza eficient în rândul bacteriilor.

Rezistenţa la β-lactamine – în 1940 a fost raportată prima enzimă bacteriană care a distrus penicilina – o β-lactamază AmpC la E. coli, iar în 1944 o altă specie bacteriană, S. aureus, distruge penicilina cu ajutorul unei β-lactamaze, numită şi penicilinază, iar acum peste 95% dintre tulpinile de S. aureus sunt rezistente la penicilină, ampicilină şi peniciline antipseudomonas (carbenicilină, piperacilină, ticarcilină)(6). Din anii 1980, rezistenţa S. aureus la meticilină (o penicilină semisintetică) devine o problemă, MRSA fiind rezistent la toate β-lactaminele (peniciline, cefalosporine, carbapeneme şi peneme); de acest fenomen este răspunzătoare gena mecA, care produce o nouă proteină de legare la penicilină, (PLP) 2a, cu o afinitate scăzută pentru antibioticele beta-lactamice.

În zilele noastre, rezistenţa bacteriană la antibioticele β-lactamice creşte în proporţie semnificativă şi a devenit o problemă obişnuită. Rezistenţa clinică la penicilină a unei tulpini de Streptococcus pneumoniae a fost raportată prima dată în 1965 de cercetători din Boston, apoi în 1967 în Australia şi în 1977 în Africa de Sud. Ulterior au fost izolate tulpini de S. pneumoniae multirezistente la antibiotice (cele mai multe tulpini de S. pneumoniae rezistente la penicilină sunt rezistente şi la cel puţin alte două clase de antibiotice).

La antibioticele β-lactamice se descriu următoarele mecanisme de rezistenţă:

Cel mai frecvent şi mai important mecanism prin care bacteriile pot deveni rezistente la β-lactamine este prin exprimarea β-lactamazelor, o clasă de enzime care hidrolizează inelul β-lactamic. Pe baza activităţii lor de a hidroliza un număr mic sau o varietate de β-lactamine, enzimele pot fi împărţite în β-lactamaze cu spectru îngust, moderat, larg şi extins (ESBL). β-lactamazele cu spectru larg sunt capabile să ofere rezistenţă la peniciline şi cefalosporine şi nu sunt inhibate de inhibitori cum ar fi acidul clavulanic şi tazobactam; exemple de β-lactamaze cu spectru extins (ESBLs) sunt enzime AmpC mediate prin plasmide şi β-lactamaze care hidrolizează carbapenemele (carbapenemaze)(39,40). În prezent sunt cunoscute peste 1150 de β-lactamaze localizate pe cromozom, plasmid şi transpozon.

Un alt mecanism de rezistenţă la antibioticele β-lactamice este alterarea PLP-urilor; β-lactaminele nu se pot lega la fel de eficient de aceste PLP-uri modificate şi devin mai puţin eficiente în inhibarea sintezei peretelui celular. PLP-urile sunt considerate a fi strămoşii β-lactamazelor, localizate pe cromozomul mai multor specii bacteriene.

Rezistenţa la glicopeptide. De-a lungul a aproape 30 de ani de la introducerea vancomicinei în terapia infecţiilor, rezistenţa faţă de acest glicopeptid a fost raportată foarte rar, vancomicina continuând să reprezinte tratamentul de rezervă în diferite infecţii severe. Cu toate acestea, la sfârşitul anilor 1980 a fost recunoscută prima dată apariţia rezistenţei dobândite la glicopeptide(41,42). Această rezistenţă la vancomicină a rezultat din producerea de precursori modificaţi ai peptidoglicanului cu terminalul d-Ala-d-Lac (fenotipurile de rezistenţă VanA, VanB şi VanD) sau d-Ala-d-Ser (fenotipurile VanC, VanE şi VanG), la care glicopeptidele prezintă afinităţi de legare scăzute. Clasificarea rezistenţei la glicopeptide se bazează pe secvenţa primară a genelor structurale pentru ligazele care mediază rezistenţa. Operonii vanA şi vanB sunt localizaţi pe plasmid sau pe cromozom, în timp ce vanC1, vanC2/3, vanD, vanE şi vanG au fost găsite, până acum, exclusiv pe cromozom. În prezent, rezistenţa la glicopeptide (vancomicină, teicoplanină sau ambele) a fost detectată în şase genuri bacteriene Gram-pozitive: Enterococcus, Erysipelothrix, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus şi Staphylococcus(43).

Rezistenţa la macrolide. La scurt timp după introducerea eritromicinei în terapie, în anii 1950, a fost raportată rezistenţa bacteriană la acest antibiotic – prima dată la stafilococi(44). De atunci, un număr mare de bacterii au prezentat o rezistenţă încrucişată la macrolide, lincozamide şi streptogramine (fenotip MLS). Cel mai frecvent mecanism de rezistenţă la MLS se datorează prezenţei rRNA-metilazelor, codificate de genele erm, responsabile de rezistenţă prin modificare ribozomală. Mecanismele de rezistenţă mai includ pompa de eflux şi genele de inactivare (codificate de genele mef, msr, ere)(18).

Rezistenţa la chinolone. De-a lungul deceniilor s-a crezut că mecanismele de rezistenţă la chinolone sunt codificate doar în cromozom, totuşi au fost raportate recent trei mecanisme de rezistenţă de origine plasmidică, fiind responsabile: i) genele qnr – codifică o proteină care protejează ADN-giraza şi topoizomeraza de tip IV faţă de acţiunea inhibitoare a chinolonelor; ii) genele responsabile de rezistenţa de nivel scăzut faţă de ciprofloxacin; iii) gena qepA, responsabilă de pompa de eflux. Rezistenţa de origine cromozomială determină fie o scădere a permeabilităţii membranei externe, împreună cu exprimarea naturală a pompelor de eflux, fie mutaţii ale ţintelor moleculare ADN-girază şi topoizomeraza IV (codificate de genele gyrA, gyrB, parC şi parE)(45).

Rezistenţa la sulfonamide în rândul bacteriilor patogene a apărut destul de curând după introducerea lor în practica clinică, în anii 1930(46). Rezistenţa de origine cromozomială este, de cele mai multe ori, de nivel scăzut, determinată de mutaţii la nivelul genei folP, care codifică enzimele bacteriene dihidropteroat-sintetază (DHPS). Rezistenţa dobândită la sulfonamide a fost descoperită în 1960, dar genele plasmidice au fost caracterizate mai târziu, în anii 1980, ca sul1 şi sul2. În prezent sunt cunoscute trei variante de rezistenţă de origine plasmidică; în afară de cele două gene menţionate mai sus, a fost identificată şi gena sul3(47).

Rezistenţa la tetracicline. Înainte de mijlocul anilor 1950, majoritatea germenilor comensali şi patogeni au fost sensibili la tetraciclină. Însă din 1953 au fost izolate primele bacterii rezistente la tetraciclină. Mecanismele de rezistenţă la tetracicline se încadrează în trei categorii: i) pompe de eflux dependente de energie, ii) proteine de protecţie ribozomală (PPR) sau iii) inactivare enzimatică. În prezent sunt recunoscute peste 40 de gene de rezistenţă câştigată – tet, otr –, gene care codifică rezistenţa la tetraciclină (38 de gene tet), rezistenţa la oxitetraciclină (3 gene otr) şi în ultima decadă a fost identificată şi gena tcr(48).

Baze genetice ale rezistenţei antimicrobiene

Mecanismele moleculare de rezistenţă la antibiotice au fost studiate extensiv, implicând cercetări de genetică şi biochimie ale funcţiei celulare bacteriene(49).

Genele de rezistenţă provin din bacteriile din mediu, unde au evoluat de milioane de ani pentru a juca diferite funcţii care includ detoxificare, trafic de semnal sau funcţii metabolice. Însă forţele selective care determină evoluţia acestor potenţiali factori de rezistenţă s-au schimbat în ultimele decenii, ca o consecinţă a presiunii puternice exercitate de utilizarea excesivă a substanţelor antimicrobiene, în special în unităţile clinice şi în fermele de animale, dar şi de contaminarea cu antibiotice a ecosistemelor naturale.

Ecosistemele naturale conţin un număr mare de gene de rezistenţă; totuşi, doar câteva dintre ele sunt prezente şi diseminate printre agenţii patogeni umani. Diferitele lucrări genomice şi metagenomice au arătat că, într-adevăr, genele care pot conferi rezistenţă la antibiotice într-o gazdă heterologă se găsesc în orice microorganism şi ecosistem studiat.

Comparaţiile plasmidelor din epocile pre- şi postantibiotice au arătat că populaţiile bacteriene au dobândit gene de rezistenţă care nu au fost prezente anterior în agenţii patogeni umani(50). O ipoteză pentru a explica originea acestor gene a fost ridicată acum câteva decenii de Julian Davies; majoritatea antimicrobienelor utilizate în prezent sunt produse de microorganisme din mediu sau sunt derivaţi ai acestor antibiotice naturale(51). Aceste microorganisme producătoare de antibiotice trebuie să posede sisteme pentru a evita activitatea antibacterienelor pe care le produc; în cazul transferului lor la agenţii patogeni umani, aceste sisteme pot deveni gene de rezistenţă. Studiul genomurilor acestor microorganisme producătoare a arătat că acestea conţin gene care aparţin aceloraşi familii ca genele de rezistenţă prezente în populaţiile de patogeni umani.

Din perspectivă evoluţionistă, bacteriile utilizează două strategii genetice majore pentru a rezista la atacul antibioticului: 1) mutaţii ale genelor care sunt asociate adesea cu mecanismul de acţiune al antibioticului şi 2) achiziţia unui fragment de ADN străin, care codifică determinanţii de rezistenţă, prin transferul orizontal de gene (HGT).

În ceea ce priveşte mutaţiile genelor care duc la rezistenţă antimicrobiană, acestea modifică acţiunea antibioticului prin unul dintre următoarele mecanisme: i) modificări ale ţintei antimicrobiene (scăderea afinităţii pentru medicament), ii) scăderea absorbţiei antibioticului, iii) activarea mecanismelor de eflux pentru scoaterea din celula bacteriană a antibioticului, iv) schimbări globale în căile metabolice importante.

Achiziţionarea de material ADN străin prin HGT este unul dintre cei mai importanţi factori ai evoluţiei bacteriene şi este frecvent responsabilă pentru dezvoltarea rezistenţei antimicrobiene. Aceasta se realizează prin trei strategii importante: i) transformarea: transferul de material genetic de la o celulă donor la una receptor sub formă de ADN eliberat de celula donor sau ADN extras chimic; ii) conjugarea: bacteriile transferă material genetic direct în altă celulă bacteriană; prin conjugare se pot transmite gene plasmidice, precum şi gene cromozomiale; iii) transducţia: mediată de bacteriofagi (virusuri bacteriene), care transferă gene cromozomiale de la o celulă bacteriană la alta.

Bacteriile dezvoltă mecanisme de rezistenţă prin utilizarea instrucţiunilor furnizate de ADN-ul lor sau de gene. O varietate de elemente genetice joacă un rol esenţial în diseminarea genelor de rezistenţă antimicrobiană: transpozonii pot transfera genele de rezistenţă intracelular, în timp ce plasmidele conjugative care poartă genele de rezistenţă se pot deplasa de la o celulă bacteriană la alta, în cadrul speciilor bacteriene din aceeaşi familie (de exemplu, între două Enterobacteriaceae, cum ar fi E. coli) şi uneori chiar şi între familii bacteriene diferite (de exemplu, de la E. coli la o specie non-Enterobacteriaceae, cum ar fi Pseudomonas aeruginosa). Plasmidele au un rol central – ca vehicule pentru captarea genelor de rezistenţă şi diseminarea lor ulterioară. Integronii sunt elemente genetice care pot colecta mai multe gene de rezistenţă sub formă de casete genetice. Aceste elemente genetice coexistă uneori şi colaborează. De exemplu, integronii, care nu sunt mobili singuri, pot obţine o capacitate de transfer când sunt încorporaţi în transpozoni.

Exemplu: utilizarea pe scară largă a antibioticelor β-lactamice a dus la evoluţia şi răspândirea multor mecanisme de rezistenţă cromozomiale, plasmidice şi transpozonice(52). Printre aceste mecanisme, un rol predominant îl au β-lactamazele; TEM-1 β-lactamaza, codificată de gena blaTEM-1, hidrolizează atât penicilinele, cât şi primele cefalosporine(53). Genele care codifică β-lactamazele sunt vechi şi s-au găsit în medii îndepărtate şi pustii, ceea ce implică faptul că noi β-lactamaze cu substraturi modificate se întâlnesc în mediul înconjurător.

În momentul actual, disponibilitatea tehnicilor de mutageneză a întregului genom bacterian şi secvenţializarea rapidă a acestuia au dezvăluit multe funcţii genetice potenţiale la nivelul bacteriilor, care pot conduce la diverse fenotipuri de rezistenţă. Testele genetice se pot folosi, de asemenea, şi în identificarea mai rapidă a rezistenţei la antibiotice, cum este, de exemplu, identificarea rezistenţei la rifampicină în cazul Mycobacterium tuberculosis folosind sistemul GenoType MTBDRplus(54), o metodă deosebit de utilă, ţinând cont de particularităţile fiecărui pacient cu această infecţie şi, în acelaşi timp, de posibilitatea crescută a rezistenţei la diferite antibiotice(55).

Un aspect important în ceea ce priveşte rezistenţa la antibiotice este reprezentat de consumul iresponsabil al acestora, de multe ori din cauza lipsei de cunoştinţe(56). Trebuie avută în vedere utilizarea corespunzătoare a antibioticelor, în funcţie de mecanismul lor de acţiune, microorganismele-ţintă şi alte aspecte, precum absorbţia intestinală sau efectele adverse(57). În unele patologii (ex.: în cazul diareii călătorului) sunt mai eficiente antibioticele cu absorbţie intestinală scăzută(58,59), în timp ce în alte situaţii, cum sunt leziunile cronice infectate, se poate apela la alte terapii, precum folosirea de nanoparticule de argint sau altele(60). Ţinând cont de recomandările societăţilor din domeniu, utilizarea corectă a antibioticelor şi a chimioterapicelor poate încetini creşterea rezistenţei la antibiotice(61).

În loc de concluzie

„Cu o rezistenţă crescândă chiar la antibioticele de ultimă instanţă, cum ar fi colistin, ne confruntăm cu un viitor postantibiotic înspăimântător, în care am putea pierde capacitatea de a efectua cu succes orice intervenţie chirurgicală majoră, transplantul de organe sau implantul de dispozitive, cum ar fi şoldurile noi ori valvele cardiace. Până în 2050, rezistenţa antimicrobiană ar putea să omoare o persoană la fiecare trei secunde şi să devină o cauză mai frecventă a morţii decât cancerul“, a tras semnalul de alarmă Vytenis Andriukaitis, comisarul pentru sănătate şi siguranţă alimentară, la European Antibiotic Awareness Day 2017 – Bruxelles, 15 noiembrie 2017. De asemenea, el a subliniat că „scopul noului plan de acţiune este menţinerea capacităţii noastre de a trata eficient infecţiile la om şi la animale“(29).

Este clar că emergenţa rezistenţei la antibiotice este o problemă importantă de sănătate publică la nivel mondial, astfel se justifică şi sunt necesare în continuare cercetări farmacologice şi biochimice ale antibioticelor pentru cunoaşterea aprofundată atât a mecanismelor de acţiune, cât şi a mecanismelor de rezistenţă.

Cunoscând unde şi cum se produc schimbările în rezistenţă, putem avea informaţii privind luarea de măsuri pentru a preveni şi încetini răspândirea rezistenţei, cum ar fi: măsurile într-un focar infecţios, dezvoltarea de noi medicamente şi dezvoltarea/îmbunătăţirea diagnosticului, îmbunătăţirea utilizării antibioticelor prin dozare şi administrare – prin instituirea unui sistem educaţional permanent privind prescrierea corectă a antibioticelor, precum şi evitarea de către pacienţi a consumului antibioticelor fără prescriere medicală.  

Conflict of interests: The author declares no conflict of interests

Bibliografie

  1. ***. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic Resistance Threats in the United States. 2013. Downloaded from http://www.cdc.gov/drugresistance/threat-report-2013/index.html.
  2. Wright GD. The antibiotic resistome: the nexus of chemical and genetic diversity. Nature Reviews Microbiology. 2007; 5(3):175-186.
  3. Preoţescu L, Nodea ME, Popa MI. Utilizarea anterioară de antibiotice, posibil factor de risc pentru infecţiile cu bacterii rezistente. Infecţio.ro. 2014;39(3):13-15.
  4. Jesman C, Młudzik A, Cybulska M. History of antibiotics and sulphonamides discoveries. Pol Merkur Lekarski. 2011; 30(179):320-2.
  5. Flemming A. Classics in infectious diseases: on the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. Brit J Exp Pathol. 1929;10;226-236.
  6. Cristea CV, Oprea M, Neacşu G, et al. Mechanisms of resistance to ciprofloxacin and genetic diversity of Escherichia coli strains originating from urine cultures performed for Romanian adults. Roum Arch Microbiol Immunol. 2015;74(3-4):73-8
  7. Begg EJ, Barclay ML. Aminoglycosides–50 years on. Br J Clin Pharmacol. 1995;39:597-603.
  8. Schatz A, Waksman SA. Effect of streptomycin and other antibiotic substances upon Mycobacterium tuberculosis and related organisms. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1944;57:244-248. 
  9. Bush K. Characterization of β-lactamases. Antimicrob Agents Chemother. 1989;33:259-263. 
  10. Kotra LP, Mobashery S. β-Lactam antibiotics, β-lactamases and bacterial resistance. Bull Inst Pasteur. 1998;96:139-150.
  11. Gaynes R. The discovery of penicillin-new insights after more than 75 years of clinical use. Emerg Infect Dis. 2017;23:849-853. Disponibil la: https://wwwnc.cdc.gov/eid/article/23/5/16-1556_article Accessed December 11, 2017.
  12. Andam CP, Worby CJ, Gierke R, et al. Penicillin resistance of nonvaccine type pneumococcus before and after PCV13 introduction, United States. Emerg Infect Dis. 2017;23:1012-1015.
  13. Vyles D, Chiu A, Simpson P, et al. Parent-reported penicillin allergy symptoms in the pediatric emergency department. Acad Pediatr. 2017;17:251-255.
  14. McCormick MH, Stark WM, Pittenger GE, et al. Vancomycina new antibiotic. I. Chemical and biological properties. Antibiot. Annu. 1955–1956;606-611. 
  15. Parenti F, Beretta G, Berti M, Arioli V. Teichomycins, new antibiotics from Actinoplanes teichomyceticus Nov. Sp. I. Description of the producer strain, fermentation studies and biological properties. J. Antibiot. 1978;31:276-283.
  16. Gao Y. Glycopeptide antibiotics and development of inhibitors to overcome vancomycin resistance. Nat. Prod. Rep. 2002;19:100-107.
  17. Roberts MC. Resistance to tetracycline, macrolide-lincosamide-streptogramin, trimethoprim, and sulfonamide drug classes. Mol. Biotechnol. 2002;20:261-284.
  18. Roberts MC. Update on macrolide-lincosamide streptogramin, ketolide, and oxazolidinone resistance genes. FEMS Microbiol Lett. 2008;282:147-159.
  19. Lescher GY, Froelich EJ, Gruett MD, et al. 1,8-Naphthyridine derivatives: a new class of chemotherapy agents. J Med Pharm Chem. 1962;5:1063-1068.
  20. Hooper DC. Mechanisms of action and resistance of older and newer fluoroquinolones. Clin Infect Dis. 2000;31:S24-S28.
  21. Muntean AA, Moisoiu A, Muntean MM, et al. Sensibilitatea la antibiotice şi chimio­terapice a microorganismelor izolate de la pacienţi cu afecţiuni bronhopulmonare, în Institutul „Marius Nasta“, în 2015. Infecţio.ro. 2016;47(3):24-37.
  22. Skold O. Resistance to trimethoprim and sulfonamides. Vet Res. 2001;32;261-273. 
  23. Cristea CV, Gheorghe I, Neacsu G, et al. Staphylococcus sp Involvement in Community Acquired Urinary Tract Infections. Rom Biotechnol Letters. 2016;21(2):11413-417.
  24. Schlecht HP, Bruno C. Tetracyclines. Merck Manual. 2015. Downloaded from
  25. http://www.merckmanuals.com/professinal/infectious-diseases/bacteria-and-antibacterial-drugs/tetracyclines. 
  26. Marosevic D, Kaevska M, Jaglic Z. Resistance to the tetracyclines and macrolide-lincosamide-streptogramin group of antibiotics and its genetic linkage – a review. Ann Agric Environ Med. 2017;24:338-344. 
  27. Chen Y, Cai Z, Ke Z. Antineuroinflammation of minocycline in stroke. Neurologist. 2017;22:120-126.
  28. ***. World Health Organization. Antimicrobial resistance: global report on surveillance 2014. Downloaded from: http://www.who.int/drugresistance/documents/surveillancereport/en/.
  29. Popa MI. Infecţiile nosocomiale din nou în actualitate. (editorial) Infecţio.ro. 2015;44(4):3.
  30. Vytenis A. Commissioner for Health and Food Safety, and Carlos Moedas, Commissioner for Research, Science and Innovation – European Antibiotic Awareness Day 2017, Brussels, 15 November 2017.
  31. D`Costa VM et al. Antibiotic resistance is ancient. Nature. 2011;477:457-461.
  32. McKenna M. Big Chicken: The Incredible Story of How Antibiotics Created Modern Agriculture and Changed the Way the World Eats Hardcover. The Amazon Book Review, September 12, 2017.
  33. Schmidt ML, Spencer MD, Davidson LE. Patient, Provider, and Practice Characteristics Associated with Inappropriate Antimicrobial Prescribing in Ambulatory Practices. Infect Control Hosp Epidemiol. 2018;1-9.
  34. Abraham EP, Chain E. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Rev. Infect. Dis. 1940;10:677-678. 
  35. Davies J. Vicious circles: looking back on resistance plasmids. Genetics. 1995;139:1465-1468. 
  36. Mihai MM, Holban AM, Giurcăneanu C, Popa LG, Oanea RM, Lazăr V, Chifiriuc MC, Popa M, Popa MI. Microbial biofilms: impact on the pathogenesis of periodontitis, cystic fibrosis, chronic wounds and medical device-related infections. Curr Top Med Chem. 2015;15(16):1552-76. 
  37. Magnet S, Blanchard JS. Molecular insights into aminoglycoside action and resistance. Chem Rev. 2005;105:477-497.
  38. Mitran CI, Mitran IM, Tampa M, et al. Mecanisme de rezistenţă a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis. Infecţio.ro. 2016;45(1):15-18.
  39. Georgina C, Stogios PJ, Savchenko A, Wrighta GD. Structural and Molecular Basis for Resistance to Aminoglycoside Antibiotics by the Adenylyltransferase ANT(2)-Ia. mBio 2015;6(1):e02180-14. doi:10.1128/mBio.02180-14.
  40. Bradford PA. Extended spectrum β-lactamase in the 21st century: characterization, epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clin Microbiol Rev. 2001;14:933-951. 
  41. Muntean MM, Muntean AA, Popa MI. Carbapenemases in Enterobacteriaceae – overview and importance. Infecţio.ro. 2017;49(1):13-16. 
  42. Leclercq R, Derlot E, Duval J, Courvalin P. Plasmid mediated resistance to vancomycin and teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med. 1988;319:157-161. 
  43. Muntean MM, Muntean AA, Popa GL, Popa MI. Noi protocoale pentru optimizarea antibioticoterapiei. Viaţa medicală. 2017;1425(18):2.
  44. Woodford N, Johnson AP, Morrison D, Speller D. Current perspectives on glycopeptide resistance. Clin Microbiol Rev. 1995;8:585-615. 
  45. Weisblum B. Erythromycin resistance by ribosome modification. Antimicrob. Agents Chemother. 1995;39:577-585.
  46. Jacoby GA. Mechanisms of resistance to quinolones. Clin Infect Dis. 2005;41:S120-S126. 
  47. Skold O. Resistance to trimethoprim and sulfonamides. Vet Res. 2001;32:261-273. 
  48. Perreten V, Boerlin P. A new sulfonamide resistance gene (sul3) in Escherichia coli is widespread in the pig population of Switzerland. Antimicrob Agents Chemother. 2003;47:1169-1172.
  49. Roberts MC. Update on acquired tetracycline resistance genes. FEMS Microbiol Lett. 2005;245:195-203.
  50. Alekshun MN, Levy SB. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 2007;128:1037-1050.
  51. Peneş N, Muntean AA, Moisoiu A, et al. An overview of resistance profiles ESKAPE pathogens from 2010–2015 in a tertiary respiratory center in Romania. Rom J Morphol Embryol. 2017; 58(3):909-922. 
  52. Benveniste R, Davies J. Aminoglycoside antibiotic inactivating enzymes in actinomycetes similar to those present in clinical isolates of antibiotic-resistant bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 1973;70(8):2276-80.
  53. Muntean AA, Poenaru A, Neagu A, et al. Carbapenemase Inhibition Challenge Method: a novel method for evaluating the presence of carbapenemases – a pilot study. Infecţio.ro. 2017;50(2):18-21
  54. Muntean MM, Muntean AA, Gauthier L, Creton E, Cotellon G, Popa MI, Bonnin R, Naas T. Evaluation of the Rapid Carbapenem Inactivation Method (rCIM): a phenotypic screening test for carbapenemase producing Enterobacteriaceae. J Antimicrobial Chemotherapy. 2018;73(4):900-908. 
  55. Moisoiu A, Popa MI. Detectarea prin tehnici de biologie moleculară a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis rezistente la rifampicină şi/sau izoniazidă folosind sistemul GenoType MTBDRplus. Rom J Inf Dis. 2014;XVII(3):147-152
  56. Moisoiu A, Mitran CI, Mitran MI, et al. Resistance pattern of multi-drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis and characteristics of patients with multi-drug resistant tuberculosis. Rom Arch Microbiol Immunol. 2016;75(1-2):25-31
  57. Popa GL, Gheorghe SA, Preda M, Popa MI. Factori ajustabili în prevenirea extinderii rezistenţei la antibiotice şi chimioterapice: nivelul de cunoştinţe şi comportamentul faţă de tratament al populaţiei din România. Viaţa medicală. 2015;1350(48):15
  58. Popa MI. Maladiile infecţioase neglijate – din nou în atenţie. Infecţio.ro. 2015;43(3):3.
  59. Popa GL, Preda M, Gheorghe SA, Popa MI. Intestinal infections of the modern era: Travelers’ diarrhea through the clinician’s eye. Infecţio.ro. 2016;46(2):5-9
  60. Popa GL, Gheorghe SA, Preda M, Popa MI. Infecţii intestinale ale epocii moderne: diareea călătorului din perspectiva medicinei preventive. Infecţio.ro. 2016;47(3):9-13 
  61. Mihai MM, Preda M, Lungu I, et al. Nanocoatings for Chronic Wound Repair – Modulation of Microbial Colonization and Biofilm Formation. Int J Mol Sciences. 2018;19(4):1179
  62. Popa GL, Popa MI. Utilizarea corectă a antibioticelor şi chimioterapicelor, o necesitate. Infecţio.ro. 2014;38(2):38-41