De la design molecular la validare biologică – noi baze Schiff cu potențial antimicrobian și antitumoral

Introducere

Rezistența la antimicrobiene (AMR) reprezintă una dintre cele mai urgente crize la nivel mondial, fiind asociată anual cu peste un milion de decese, având un impact major asupra sistemului de sănătate publică^(1,2). În ciuda eforturilor depuse pentru descoperirea de noi agenți antimicrobieni, substanțele ajunse în studii clinice și preclinice nu acoperă nevoile terapeutice actuale⁽²⁾, cercetările în domeniul dezvoltării și descoperirii de noi agenți terapeutici care să trateze bolile infecțioase produse de microorganismele rezistente prioritare fiind astfel imperios încurajate^(2,3).

O situație asemănătoare se constată și în sfera bolilor oncologice, a doua cauză de deces în rândul populației globale⁽⁴⁾. Incidența lor crescută și limitările terapiilor actuale (efectele adverse semnificative și apariția rezistenței la tratament) accentuează identificarea unor noi compuși bioactivi cu profil de siguranță îmbunătățit și cu mecanisme inovatoare⁽⁵⁾. Accentul cade pe identificarea de agenți terapeutici multifuncționali (molecule mici, dar și biomolecule), care să acționeze asupra mai multor mecanisme cumulate pentru creșterea eficienței și reducerea rezistenței la chimioterapie^(6,7).

În realizarea acestor deziderate, pe lângă profilul farmacologic și toxicologic favorabil, o importanță deosebită o au și implicațiile procesului de sinteză. În mod ideal, un medicament trebuie să fie sigur și eficient, dar totodată să fie obținut într-o manieră sustenabilă și cu un impact cât mai redus asupra mediului înconjurător⁽⁸⁾. În acest context, au fost introduse principiile chimiei verzi, o inițiativă la nivel global care urmărește „conceperea de produși chimici folosind materii prime reutilizabile și procese care să reducă sau să înlăture complet utilizarea și generarea de reactivi și solvenți toxici pe tot parcursul etapelor de sinteză și de aplicare ulterioară”⁽⁹⁾.

Articolul de față își propune să evidențieze potențialul terapeutic al unor noi baze Schiff obținute prin hibridizare moleculară, explorând totodată avantajele sintezei asistate de microunde ca abordare sustenabilă, aliniată principiilor chimiei verzi. Sunt prezentate două studii de caz, cercetări originale efectuate la disciplina Chimie farmaceutică a Universității de Medicină și Farmacie „Carol Davila” din București.

Metodă

Studiul se bazează pe rezultatele unei cercetări doctorale desfășurate la catedra anterior menționată și valorificate în trei articole originale^(10-12).

Rezultate

Introducere în chimia bazelor Schiff

Bazele Schiff sunt derivați funcționali ai compușilor carbonilici, rezultați prin substituția grupei carbonil (C=O) sub acțiunea nucleofililor cu caracter bazic^(13-15). Numele lor a fost dat de chimistul Hugo Schiff, care le-a descoperit în 1864 reacționând anilina cu diverse aldehide aromatice⁽¹⁶⁾.

Din perspectiva chimiei medicamentului, bazele Schiff constituie o resursă versatilă pentru dezvoltarea de molecule bioactive datorită mai multor proprietăți. Acestea conțin în moleculă grupa azometinică >C=N-, fapt care le imprimă polaritate și capacitatea de a forma legături de hidrogen și coordinative^(16,17). Astfel sunt modulate proprietățile fizico-chimice, cum ar fi solubilitatea în apă și proprietatea de a forma combinații complexe metalice, respectiv profilul farmacodinamic, prin interacțiunea moleculelor cu țintele biologice^(10,18). De asemenea, în strategiile de design molecular, grupa azometinică poate fi folosită ca înlocuitor bioizoster pentru grupele carbonil, amidă sau eter⁽¹⁰⁾ sau poate juca rol de element de legătură între două fragmente moleculare⁽¹⁸⁾.

În terapia actuală, ca baze Schiff pot fi încadrate medicamente din rândul antimicrobienelor și chimioterapicelor. Câteva exemple relevante sunt medicamentele folosite în tratamentul tuberculozei multirezistente: terizidona, derivat de cicloserină, analog al D-alaninei, respectiv riminofenazinele clofazimină⁽¹⁹⁾ și, mai nou, pirifazimina, cea din urmă aflată în studii clinice de fază 2 (figura 1)^(20,21). În sfera anticanceroasă se numără aldoxorubicina, promedicament de tip N-acil-hidrazonă al doxorubicinei, pentru care a fost evaluată eficacitatea preliminară și siguranța în rândul pacienților cu sarcom de țesut moale inoperabil sau metastatic (figura 1)^(22,23).

Strategia de hibridizare moleculară – arhitectura noilor molecule

O strategie a designului molecular modern este hibridizarea moleculară care presupune fuzionarea a doi sau mai mulți farmacofori (fragmente moleculare cu activitate biologică prestabilită) într-o entitate unică^(24,25). Dincolo de beneficiul dublu, potențarea acțiunii farmacologice și atenuarea reacțiilor adverse, hibridizarea reprezintă o strategie economică riguroasă prin modificarea unor substanțe utilizate în terapie pentru a induce noi proprietăți sau a îmbunătăți profilul terapeutic actual^(24-28).

În acest context, valorificarea sulfonamidelor bacteriostatice consacrate prin cuplarea cu diverse aldehide aromatice a condus la obținerea de baze Schiff cu un profil biologic variat: efect antibacterian pe coci Gram-pozitivi^(29-32), antibiofilm⁽³³⁾, antimicobacterian⁽²⁹⁾ și antifungic^(29-33), un rol deosebit avându-l prezența grupelor halogen în structura moleculelor (figura 1)^(29-32). De asemenea, se remarcă efectul anticanceros atât ca liganzi⁽³⁴⁾, cât și în combinații complexe^(35-37), precum și efectul inhibitor asupra izoformelor supraexprimate în cancer ale anhidrazei carbonice (AC IX, AC XII; figura 1)^(34,38,39).

În plus, îmbinarea nucleului chinazolin-4(3H)-onic, farmacofor cu importanță atât în rândul compușilor naturali, cât și al celor de sinteză^(40,41), cu diverse nuclee aromatice substituite a condus la baze Schiff cu efecte în sfera anticanceroasă^(42-45), antibacteriană și antibiofilm⁽⁴⁶⁾, dar și antituberculoasă⁽⁴⁷⁾. Un exemplu elocvent îl reprezintă (E)‑N’‑benziliden‑2‑(4‑oxochinazolin‑3(4H)‑il)acetohidrazidele, care au fost concepute plecând de la modelul activatorului de procaspază PAC-1 și care au prezentat proprietăți anticanceroase superioare acestuia^(42,44,45).

Sinteza asistată de microunde și importanța chimiei verzi

Orientarea către metode alternative de sinteză reprezintă unul dintre principiile chimiei verzi, care se axează pe maximizarea eficienței reacției chimice prin utilizarea de tehnici moderne, cum ar fi sinteza sub acțiunea microundelor⁽⁴⁸⁾. Aceasta reprezintă o tehnică modernă de sinteză organică ce utilizează radiația din domeniul microundelor pentru a desfășura procesele chimice^(49-51). Această tehnică a luat amploare în anii 1980, ajungând în prezent să fie considerată deja cu tradiție în domeniul chimiei⁽⁵²⁾.

Față de sinteza convențională prin refluxare, sinteza asistată de microunde permite o încălzire mult mai eficientă a amestecului de reacție ca urmare a distribuției directe a energiei electromagnetice către acesta, vasul de reacție fiind transparent la radiația din domeniul microundelor. În consecință, viteza de reacție crește, timpul de reacție se reduce, iar randamentele de proces sunt mărite concomitent. De asemenea, încălzirea dielectrică uniformă minimizează reacțiile secundare, oferind un profil cinetic mai curat. Tranziția către protocoalele de sinteză sub acțiunea microundelor marchează alinierea chimiei farmaceutice la principiile sustenabilității⁽⁵¹⁾.

Studiu de caz: baze Schiff – derivați ai sulfanilamidei și 2-(2-metil-4-oxochinazolin-3(4H)-il)acetohidrazidei

Această cercetare fundamentează ipoteza optimizării unor farmacofori consacrați, sulfanilamida⁽¹²⁾ și 2-(2-metil-4-oxochinazolin-3(4H)-il)acetohidrazida⁽¹¹⁾, prin transformarea acestora în baze Schiff hibride, vizând obținerea unor agenți cu proprietăți antimicrobiene, anticanceroase și antioxidante îmbunătățite (figura 2). Obiectivele specifice au vizat transpunerea sintezei în spectrul chimiei verzi prin utilizarea microundelor, caracterizarea spectrală exhaustivă pentru confirmarea structurii și identificarea potențialilor izomeri, evaluări biologice in vitro și in vivo pentru a determina eficacitatea și siguranța noilor molecule, respectiv validarea mecanismelor de acțiune prin andocare moleculară pe ținte enzimatice specifice fiecărei serii. Această abordare integrată facilitează identificarea unor noi precursori cu indice terapeutic optimizat și toxicitate sistemică redusă.

Metodologia de sinteză și optimizarea profilului cinetic prin chimie verde

Utilizarea reactorului Biotage® Initiator Classic 2.0 (figura 3) a permis operarea în sistem închis, asigurând un control riguros al presiunii și temperaturii, cu următoarele beneficii tehnice: reducerea timpului de reacție de la ordinul orelor la 10-40 de minute^(11,12), obținerea unor profiluri cinetice curate, produșii fiind frecvent izolați cu puritate ridicată direct din mediul de reacție⁽¹¹⁾, înlocuirea solvenților toxici (precum THF⁽⁵³⁾) cu etanol, aliniind procesul la principiile chimiei ecologice⁽¹²⁾.

Confirmarea structurală a fost realizată printr-un cumul de tehnici spectrale: spectroscopie de rezonanță magnetică nucleară (RMN), spectrometrie de masă de înaltă rezoluție (HRMS), spectroscopie absorbție în infraroșu (IR). Analiza spectrală a pus în evidență coexistența izomerilor conformaționali sin-E și anti‑E caracteristici grupei N-acil-hidrazonice⁽¹¹⁾, în timp ce bazele Schiff ale sulfanilamidei au prezentat un singur izomer geometric pe legătura azometinică, izomerul E⁽¹²⁾.

Profilul farmacologic al bazelor Schiff ale sulfanilamidei

Derivații sulfonamidici au demonstrat o selectivitate pronunțată pentru bacteriile Gram-pozitive, unde natura și poziția substituenților halogeni pe nucleul aldehidic joacă un rol determinant în potențarea activității. Compușii 2 (2-Br) și 4 (3,5-diCl) s-au identificat ca agenți antistafilococici de elecție, cu valori ale concentrației minime inhibitorii (CMI) între 0,014 și 0,019 mg/mL, depășind semnificativ potența sulfanilamidei (CMI 0,39 mg/mL)⁽¹²⁾.

Evaluarea acțiunii citotoxice a fost efectuată asupra a două linii celulare tumorale: de adenocarcinom colorectal (HT-29) și de glioblastom (LN229). Derivații 3 (2,6-diCl) și 4 (3,5-diCl) au indus o reducere drastică a viabilității celulare pe liniile HT-29 și LN229. Notabil, pentru compusul 3, activitatea citotoxică a fost evaluată la doze de opt ori mai mici decât ale sulfanilamidei⁽¹²⁾.

Simulările in silico au validat corelațiile experimentale, oferind o perspectivă moleculară asupra interacțiunilor ligand-receptor. Astfel, pentru acțiunea antibacteriană, ținta principală identificată a fost dihidropteroat sintaza (DHPS) din S. aureus. Studiile de andocare moleculară au evidențiat rolul crucial al grupei sulfamoil pentru interacțiunea cu aminoacizii din situsul activ al enzimei, în timp ce grupa azometinică și substituenții nucleului benzenic contribuie cu legături suplimentare⁽¹²⁾.

Evaluarea complexă a N-acil-hidrazonelor cu structură chinazolin-4(3H)-onică

Designul molecular al acestei serii a vizat conservarea farmacoforului reprezentat de (E)-N’‑benziliden-2-(4-oxochinazolin-3(4H)-il)acetohidrazidă și varierea substituenților de pe nucleul benzenic pentru modularea acțiunii și a proprietăților fizico-chimice⁽¹¹⁾. Profilul biologic a fost unul complex, urmărind acțiuni în sfera antioxidantă, antimicrobiană, anticanceroasă, complementat cu evaluarea preliminară a toxicității acute in vivo pe o specie de crustacee⁽¹¹⁾.

Prezența grupelor hidroxi și nitro a condus la o dublare a capacității de captare a radicalilor liberi față de materia primă⁽¹¹⁾. Substituția cu grupe 3,5-dibromo pe nucleul salicilaldehidei potențează selectiv efectul antistafilococic, compusul 7 prezentând atât acțiune calitativă, cât și cantitativă pe S. aureus (diametrul zonei de inhibiție, DIZ: 12,33 ± 0,58 mm; CMI: 0,3125 mg/mL; concentrația inhibitorie 50%, IC₅₀: 0,0857 mg/mL). Transformarea în N-acil-hidrazonă s-a dovedit însă nefavorabilă pentru acțiunea pe C. albicans, noii compuși având o activitate redusă⁽¹¹⁾.

Potențialul citotoxic a fost investigat pe linii celulare tumorale umane: HT-29 (adenocarcinom colorectal) și A431 (carcinom epidermoid), iar selectivitatea a fost evaluată prin raportare la linia celulară noncanceroasă VERO (celule epiteliale renale).

Potențial anticancerigen a fost remarcat în cazul a patru derivați (6-9) care au prezentat citotoxicitate selectivă pe liniile tumorale HT-29 și A431 similară cu cea a substanței de referință 5-fluorouracil, în timp ce, remarcabil, acțiunea pe linia VERO a fost limitată sau absentă⁽¹¹⁾.

Toxicitatea acută in vivo a fost evaluată pe specia de crustacee Artemia franciscana Kellog. Aceasta a oferit date critice privind siguranța biologică a noilor molecule, compușii prezentând în total o toxicitate redusă, letalitatea nedepășind 40% nici la 48 de ore. Studiile conduc la concluzia că hibridizarea sub formă de bază Schiff reduce semnificativ toxicitatea sistemică a farmacoforilor de bază⁽¹¹⁾.

Pentru acești hibrizi, mecanismul de acțiune a fost evaluat prin studii de andocare moleculară pe enzime reprezentative pentru chimioterapicele cu nucleu chinazolinonic: ADN-giraza B și dihidrofolat-reductaza (DHFR) din S. aureus pentru efectul antibacterian, respectiv EGFR kinaza pentru acțiunea anticanceroasă. Derivatul 7 ocupă situl activ al girazei B, respectând orientarea inhibitorilor clasici. În cazul EGFR kinazei, derivații 8 și 9 ocupă buzunarul pentru adenină prin nucleul chinazolinonic, în timp ce radicalul fenil se orientează către buzunarul K⁽¹¹⁾.

Concluzii

Prin strategii inteligente de hibridizare și metode de sinteză ecologice, molecule consacrate pot fi transformate în soluții terapeutice inovatoare, adaptate provocărilor medicale contemporane. Rezultatele celor două studii prezentate evidențiază succesul utilizării chimiei verzi prin reducerea timpului de reacție și obținerea unor derivați originali cu o activitate terapeutică superioară medicamentelor de referință. Substituția cu doi atomi de clor pe nucleul benzenic optimizează dualitatea acțiunii antibacteriene și citotoxice în sfera derivaților sulfanilamidei, în timp ce substituția cu grupe 3,5-dibromo pe nucleul de salicilaldehidă este critică pentru activitatea antistafilococică și antitumorală a chinazolinonelor. Cele două studii subliniază importanța substituției cu halogeni în modularea profilului farmacologic și deschid noi direcții în terapia bolilor infecțioase și oncologice.

Conflict de interese: niciunul declarat.

Suport financiar: niciunul declarat.

Acest articol este accesibil online, fără taxă, fiind publicat sub licența CC-BY.