Detecţia mutaţiilor trombofilice în boala abortivă recurentă

Introducere

Statusul protrombotic a fost întotdeauna asociat cu fiziopatologia multor posibile complicaţii obstetricale ce au ca origine afectarea placentară (preeclampsia, insuficienţa de creştere intrauterină, dezlipirea de placenta normal inserată şi moartea fetală in utero). În conformitate cu Societatea Europeană de Reproducere Umană şi Embriologie (ESHRE), boala abortivă recurentă este reprezentată de pierderea recurentă consecutivă a cel puţin trei sarcini la mai puţin de 20 de săptămâni de gestaţie. Aceasta poate reprezenta până la 2% din totalul pierderilor de sarcină^(1,2).

Cu toate acestea, există păreri care susţin că existenţa a două sau mai multe avorturi nu neapărat consecutive pot fi asociate cu boala abortivă⁽³⁾. Pierderea unei sarcini indiferent de vârsta gestaţională la care se produce este un eveniment nefericit care afectează viaţa cuplului şi determină apariţia unui stres extraordinar în momentul unei viitoare sarcini.

Cu ajutorul investigaţiilor paraclinice de prim nivel (ecografie, histerosalpingografie, histeroscopie, laparoscopie) se încearcă identificarea pacientelor cu modificări anatomice şi de funcţionalitate ale aparatului genital. Folosindu-se aceste metode, putem determina până la 15% din cauzele pierderilor de sarcină, încercându-se astfel identificarea unui tratament precis şi ţintit pentru rezolvarea cauzei⁽⁴⁾. Un alt aspect important îl reprezintă anomaliile cromozomiale care pot fi incriminate în apariţia avorturilor de prim trimestru⁽⁵⁾. Folosindu-ne de noile achiziţii dobândite în cadrul biologiei moleculare, procentul de pierderi de sarcină inexplicabile s-a redus la 2-5%, putându-se diagnostica mutaţii trombofilice în 15-18% din cazuri⁽⁶⁾.

În ultimii ani, detecţia mutaţiilor trombofilice a câştigat unul dintre locurile fruntaşe printre factorii de risc răspunzători de pierderile recurente de sarcină. În literatura de specialitate există lucrări care sugerează o strânsă interrelaţie între trombofiliile ereditare şi pierderile recurente de sarcină. Cu toate acestea, în contrapartidă există cercetători care nu susţin o cauzalitate între ele⁽⁷⁾.

Trombofiliile sunt consecinţele mutaţiilor polimorfice la nivelul genelor care codifică factorii de coagulare şi care astfel predispun la apariţia unui status procoagulant la nivelul circulaţiei utero-placentare. Tromboza la nivelul vaselor deciduale poate duce la complicaţii majore precum insuficienţa de creştere intrauterină, preeclampsie, abruptio placentae, moarte fetală şi implicit boala abortivă recurentă⁽⁸⁾.

Există două tipuri de trombofilii: dobândite şi ereditare. Primul tip face referinţă la sindromul antifosfolipidic, care este cel mai răspândit tip de trombofilie dobândită, cu importanţă majoră dovedită în apariţia pierderilor de sarcină.

Trombofiliile ereditare sunt definite, conform Societăţii de Tromboză şi Hemostază, ca o tendinţă genetică pentru evenimente trombotice care sunt evidenţiate clinic încă de la vârsta reproductivă, cu recidive frecvente, fără cauză aparentă. Transmiterea caracteristicilor trombofiliilor nu respectă regulile mendeliene şi există posibilitatea ca o pacientă să aibă o mutaţie homozigotă pentru un factor de coagulare, fapt ce îi asigură un risc mult sporit pentru apariţia complicaţiilor. De asemenea, decelarea mai multor mutaţii în cazul aceleiaşi paciente creşte semnificativ riscul pentru iniţierea unui episod trombotic pe parcursul sarcinii⁽⁹⁾.

Într-o metaanaliză, Rey a arătat o creştere a riscului de pierdere a sarcinii de două ori pentru perioada gestaţională mai mică de 13 săptămâni şi de 7,8 ori pentru perioada săptămânilor 13-19 pentru pacientele purtătoare de mutaţie a factorului V Leiden. Riscul era crescut de 2,6 ori pentru pacientele cu mutaţia factorului II şi de 3,5 ori pentru pacientele cu deficit de proteina C⁽¹⁰⁾.

Cele mai cunoscute trombofilii ereditare sunt reprezentate de: factor V Leiden mutaţia G1691A, MTHFR mutaţia A1298C; MTHFR mutaţia C677T; fibrinogen mutaţia G455A; factor II (protrombina) mutaţia G20210A; PAI-1 polimorfismul 4G/5G. Acestea au fost investigate în grupul de studiu pentru a se observa prevalenţa acestora în cadrul unei populaţii cu avorturi recurente.

Material şi metodă

În ţara noastră nu au fost prezentate studii cu privire la prevalenţa trombofiliei în populaţie şi implicit în incidenţa asocierii acesteia cu boala abortivă recurentă. Studiul a fost efectuat prin intermediul laboratului de genetică Genetic Lab, unde au fost testate 231 de paciente cu avorturi recurente şi 100 în lotul de control în perioada august 2012 - ianuarie 2014.

Am considerat de bun augur să căutăm prevalenţa mutaţiilor trombofilice la pacientele cu cel puţin două sarcini pierdute care nu au dus nici o sarcină la termen, cu menţiunea că unele dintre ele au avut şi manifestări tromboembolice separate. Acestea au fost luate în considerare în analiza pacientelor şi inventariate separat. Rezultatele au fost comparate cu un lot martor de 100 de paciente care au dus cel puţin o sarcină la termen şi au avut maximum un avort în antecedente.

Mostrele de sânge s-au prelevat de la paciente care nu au primit medicaţie anticoagulantă şi care să nu fi avut un eveniment obstetrical în ultimele două luni. Acest lucru a fost luat în considerare pentru a preveni modificările la nivelul valorilor proteinei C activate şi a proteinelor implicate în coagulare.

Pacienţi

Pacienţii au semnat un consimţământ informat prin care s-a asigurat păstrarea confidenţialităţii, identităţii şi a rezultatului obţinut.

Extracţia ADN-ului

De la fiecare pacient s-au recoltat câte 2 ml sânge periferic prin venipunctură în vacutainere cu anticoagulant EDTA. ADN-ul a fost izolat din 200 µl sânge periferic utilizând QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN).

Detecţia mutaţiilor genelor
pentru factorul V (G1691A) şi factorul II (G20210A) al coagulării prin Real-Time PCR

Probele ADN au fost analizate utilizând factor V Leiden Kit şi respectiv factor II (Prothrombin) Kit conform instrucţiunilor producătorului (Roche). Detecţia mutaţiilor G1691A şi G20210 s-a realizat prin Real Time PCR pe aparatul Light Cycler 480 II (Roche). Testul se bazează pe tehnologia FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) pentru amplificarea ADN, urmată de analiza curbei de topire pentru determinarea genotipurilor homozigot normal, homozigot mutant sau heterozigot. În timpul etapei de topire, temperatura crescută determină scăderea fluorescenţei, deoarece cea mai scurtă dintre cele două sonde fluorescente disociază prima şi fluoroforii nu mai sunt în imediata apropiere. În cazul prezenţei mutaţiilor G1691A sau G20210, nepotrivirea perfectă a sondei cu ADN ţintă destabilizează catenele ADN şi scăderea fluorescenţei se va produce la o temperatură mai joasă. În cazul genotipului normal, potrivirea pe bază de complementaritate este perfectă şi, prin urmare, heteroduplexul ADN are temperatura de topire mai mare. Genotipul heterozigot va prezenta două semnale fluorescente la ambele temperaturi de topire.

Detecţia mutaţiilor genei MTHFR
prin PCR-RFLP

Pentru detecţia mutaţiilor C677T şi A1298C s-au folosit primerii citaţi în literatura de specialitate⁽¹¹⁾. Pentru fiecare mutaţie s-a realizat o reacţie PCR. Ambele reacţii au avut loc în aceleaşi condiţii. 500 ng ADN genomic a fost amplificat într-un volum de reacţie de 25 µl cu 1,5 U Taq ADN polimerază (Promega, Madison, USA), 10 pmoli fiecare primer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 mM dNTP, în tampon 1X (10 mM Tris-HCl pH 9, 50 mM NaCl). În ambele reacţii s-au folosit controale pozitive reprezentate de ADN mutant homozigot şi ADN heterozigot pentru mutaţia C677T şi respectiv A1298C. Ciclurile de amplificare PCR au constat în denaturarea ADN 1 minut la 95°C, hibridizarea primerilor 30 s la 63°C şi elongarea primerilor 30 s la 72°C pentru 35 de cicluri, urmate de un pas final de extensie la 72°C, timp de 7 minute. Pentru amplificarea PCR s-a folosit GeneAmp PCR System 9700 thermal cycler⁽¹¹⁾.

Mărimea produşilor de amplificare este de 228 pb pentru C677T şi respectiv 128 pb pentru A1298C. Restricţia ampliconilor rezultaţi în urma reacţiei PCR s-a realizat cu enzima Hinf I (Promega) pentru detecţia polimorfismului C677T şi cu enzima Mbo II (Promega) pentru detecţia polimorfismului A1298C. După efectuarea reacţiei de restricţie cu Hinf I, respectiv Mbo II, produşii de reacţie au fost vizualizaţi în gel de agaroză 4%. Polimorfismul C677T creează un situs de restricţie pentru enzima Hinf I, astfel încât persoanele homozigote pentru această mutaţie (genotip TT) vor prezenta un fragment de restricţie la 172pb. Persoanele homozigote normale (genotip CC) vor prezenta un singur fragment nerestrictat la 228 pb, iar persoanele heterozigote (genotip CT) vor prezenta ambele fragmente: 228pb şi 172pb. Polimorfismul A1298C distruge un situs de restricţie şi creează un nou situs, astfel încât persoanele cu mutaţie homozigotă (genotip CC) vor prezenta un fragment de restricţie de 100pb, iar persoanele homozigote normale (genotip AA) vor prezenta un fragment de restricţie la 72pb. Persoanele heterozigote (genotip AC) vor prezenta ambele fragmente de restricţie: 100pb şi 72pb.

Rezultate

Vârsta medie a lotului studiat cu boala abortivă recurentă a fost mai mică decât cea a lotului martor, 30 versus 34 de ani. Caracteristicile etnice au fost aceleaşi, neexistând discrepanţe între ele. Considerăm că vârsta la care a debutat menarha, stilul de viaţă (consumul de alcool, tutun) nu sunt relevante pentru o diferenţă semnificativă între cazurile clinice şi cele din grupul de control (tabelul 1).

Au fost luate în considerare rezultatele a 191 de paciente care au avut cel puţin o mutaţie trombofilică din cele 231 de probe analizate (tabelul 2). Astfel, un procent covârşitor de 82% din probe a fost pozitiv pentru cel puţin o mutaţie. În lotul studiat, cea mai frecventă mutaţie genetică decelată a fost 4G/5G (inhibitorul activatorului de plasminogen) atât în forma heterozigotă, în proporţie de 63,1%, cât şi în forma homozigotă, 27,9%. Al doilea loc în incidenţă a fost ocupat de mutaţia C677T (polimorfismul enzimei metilen tetrahidrofolatreductazei) cu 133 de paciente pozitive (75,2% heterozigote şi 24,8% homozigote). Un lucru interesant a fost prezenţa a două cazuri de mutaţie homozigotă pentru factorul II G20210A, mutaţie foarte rară, cu prognostic sever în avorturile recurente. 40 de paciente din grupul investigat nu au avut nici un fel de modificare trombofilică, în cazul lor fiind necesare analize suplimentare pentru a putea avea un indiciu privind cauza avorturilor recurente. Rezultatele grupului de control de 100 de paciente sunt prezentate în tabelul 3.

Suma tuturor alteraţiilor genetice a fost 518, ceea ce înseamnă că există paciente cu multiple alteraţii simultane trombofilice, numărul maxim de alteraţii în cazul unei paciente fiind de 4. Numărul multiplu de polimorfisme genetice diagnosticate în cazul unei paciente s-a dovedit a fi un risc mai mare pentru apariţia complicaţiilor în timpul sarcinii atât în primul trimestru de sarcină, cât şi ulterior în cazul complicaţiilor tardive, respectiv dezilipirea de placenta normal inserată, insuficienţa de creştere intrauterină, preeclampsia şi moartea fetală in utero^(12,13). 

Discuţii

Am investigat frecvenţa a şase mutaţii ale factorilor de coagulare şi incidenţa acestora în rândul pacientelor cu avorturi recurente. Limitele acestui studiu reprezintă numărul relativ redus de paciente în cele două grupuri.

Rezultatele decelate arată o prevalenţă crescută a polimorfismului factorilor de coagulare în grupul pacientelor cu boală abortivă recurentă. Acest lucru vine să sublinieze încă o dată asocierea acestei patologii cu tromboza vaselor deciduale şi implicit dificultatea implantării şi asigurării nutriţiei embrionului. Cu toate acestea, şi alte mecanisme pot fi invocate pentru prognosticul nefavorabil al pacientelor cu trombofilie, precum lezarea vaselor deciduale sau reducerea invaziei trofoblastului.

Mutaţia factorului V Leiden şi MTHFR C677T au avut o frecvenţă semnificativ crescută în primul grup. Factorul V Leiden se regăseşte într-un număr crescut în populaţia caucaziană din estul Europei⁽¹⁴⁾. Cu toate acestea, incidenţa lui este foarte scăzută în Asia, Africa şi Australia⁽¹⁵⁾.

Putem observa faptul că în grupul de control nu au fost regăsite paciente cu mutaţii homozigote pentru factorul V Leiden versus 9 cazuri în grupul-ţintă, de aici şi ipoteza că prezenţa acestei mutaţii este strâns legată de un risc crescut pentru rezistenţa la proteina C activată. Cu toate acestea, prezenţa mutaţiei factorului V poate avea şi un efect pozitiv, conferind pacientelor un risc mai scăzut de apariţie a sângerărilor postpartum, acestea având o oarecare protecţie în cazul unui episod hemoragic ulterior naşterii⁽¹⁶⁾.

Asocierea cu cel mai puternic răsunet în boala abortivă recurentă a fost în 26 de cazuri care au fost pozitive pentru cel puţin 4 mutaţii trombofilice: factor V Leiden G1691A, MTHFR C677T, fibrinogen G455A şi polimorfismul PAI 4G/5G, toate pacientele având minimum 3 sarcini pierdute.

Au fost depistate în grupul investigat două cazuri de mutaţie homozigotă a factorului II G20210A şi nici unul în grupul de control. Alintas et al., într-un studiu efectuat pe 114 pacienţi, au arătat că nu au găsit o semnificaţie statistică pentru avorturile de prim trimestru pentru mutaţia G20210A⁽⁷⁾. Cu toate acestea, trebuie menţionat că în cazul nostru ambele paciente cu mutaţie homozigotă pentru factorul II aveau 3 avorturi recurente, una dintre ele fiind pozitivă de asemenea şi pentru PAI 4G/5G forma homozigotă.

Un alt aspect relevat de studiu a fost vârsta gestaţională medie la care s-a produs pierderea sarcinii, respectiv 9,2 săptămâni, putând trage concluzia că incidenţa bolii abortive a fost preponderentă în primul trimestru de sarcină. Comparativ, într-un studiu prezentat  de Viser et al., vârsta medie a sarcinilor pierdute a fost de 12,3 săptămâni de gestaţie, la limita de trecere a perioadei primului trimestru de sarcină⁽¹⁷⁾. Apariţia unei pierderi de sarcină în cazul pacientelor trombofilice este un eveniment nefericit şi relativ sporadic. Cu toate acestea, însă, frecvenţa complicaţiilor în cazul acestora (IUGR, moarte fetală in utero, dezlipirea de placenta normal inserată) este semnificativ crescută⁽¹⁸⁾. Este probabil necesar încă cel puţin un factor trigger care să acţioneze sistemic sau local la nivel placentar pentru a determina apariţia unui prognostic nefavorabil⁽¹⁸⁾.

Limitele studiului nostru s-au datorat numărului relativ redus de eşantioane analizate, acest aspect existând din cauza costurilor relativ ridicate ale procesării analizelor.

Totodată, suntem convinşi că există o bază mult mai largă de paciente cu boală abortivă recurentă care nu au cunoştinţe despre noţiunile asociate trombofiliei şi de aici nevoia de familiarizare atât a acestora, cât şi a medicilor cu posibilitatea existenţei mutaţiilor şi cu efectele pe care acestea le pot avea asupra vieţii reproductive. În concluzie, noi am sugera testarea de rutină a pacientelor cu minimum două avorturi recurente pentru markerii de trombofilie pentru a putea decela precoce existenţa lor. Depistarea acestora poate oferi oportunitatea identificării femeilor cărora li s-ar putea aplica protocoale de tratament pentru a îmbunătăţi rata de obţinere şi posibilitatea de a duce la bun sfârşit o sarcină.

Menţiune: Această lucrare este parţial sprijinită de către Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane POSDRU finanţat din Fondul Social European şi de către Guvernul României prin contractul POSDRU 141531.

Autor corespondent: Dr. Andrei Oncescu e-mail: andreioncescu@yahoo.com