Evaluarea efectului statinelor asupra procesului de calusare prin metoda spectroscopiei în infraroşu cu transformare Fourier (FT-IR)

Introducere

Osul este un ţesut dinamic care se formează şi se resoarbe constant ca răspuns la modificări mecanice şi alţi factori, cum ar fi concentraţia calciului, stimuli pa­racrini şi endocrini. Apariţia unei fracturi iniţiază o cas­cadă de procese inflamatorii, reparatorii şi de remo­de­lare. Reparaţia osului se realizează prin osificare indirectă şi osificare directă. Osificarea indirectă este cea mai frecventă şi are loc atunci când osul fracturat nu a fost fixat rigid, existând astfel o mobilitate mică la locul fracturii. Osificarea directă are loc atunci când a existat o fixare rigidă a osului. Osteogeneza reparatorie secundară prezintă cinci etape clasice: etapa formării hematomului, etapa inflamatorie, etapa ţesutului de granulaţie, etapa formării calusului şi etapa de remodelare a calusului⁽¹⁾.

Prima etapă de vindecare osoasă este reprezentată de formarea hematomului. A doua etapă este cea de inflamaţie acută. În această etapă se formează o reţea de fibrină care serveşte ca matrice provizorie pentru celulele inflamatorii. Neutrofilele ajung la locul de fractură în primele 24 de ore, unde secretă mediatori ai inflamaţiei şi mediatori chimiotactici, ceea ce determină al doilea val de infiltrat de celule inflamatorii, reprezentat de monocite şi macrofage. Macrofagele secretă şi mediatori chimiotactici, inflamatori ce iniţiază recrutarea fibroblaştilor, a celulelor stem mezenchimale şi a celulelor osteoprogenitoare din măduva osoasă locală, periost şi pereţii capilari⁽²⁾.

Hematomul şi inflamaţia acută vor fi înlocuite de ţesutul de granulaţie, acesta reprezentând a treia etapă de vindecare osoasă⁽³⁾. Următoarea etapă a procesului de vindecare osoasă este reprezentată de formarea calusului. Procesul se datorează celulelor mezenchimale tinere recrutate şi celulelor osteoprogenitoare periostale care se diferenţiază în osteoblaşti, aceştia formând direct ţesut osos. Până la urmă, ţesutul osos acoperă suprafaţa externă a calusului fibrocartilaginos, oferind astfel stabilitate mecanică suplimentară⁽⁴⁾.

Procesul continuă cu hipertrofia condrocitelor din calusul moale care secretă calciu şi mediatori ce sti­mu­lea­ză îngroşarea vaselor sanguine, în urma îmbu­nă­tăţirii vascularizaţiei, observându-se vindecarea lo­cu­ri­lor de fractură în paralel cu diferenţierea celulelor osteo­pro­ge­ni­toare în osteoblaste şi, prin urmare, depunerea de ţe­sut osos pe cartilaj. În procesul de vindecare, acesta re­pre­zin­tă stadiul formării calusului dur.

Ultima etapă a procesului de vindecare este repre­zen­tată de remodelarea osoasă. Această etapă este iniţiată de osteoclaste, care încep îndepărtarea ţesutului osos imatur şi a matricei cartilaginoase subiacente. Procesul de remodelare are ca rezultat restabilirea structurii tipice de osteon şi sistem haversian, având o durată mult mai lungă decât a celorlalte etape⁽⁵⁾.

Procesul de vindecare al fracturilor este similar la rozătoare şi animalele mai mari, dar la rozătoare are loc într-o perioadă mai scurtă. Astfel, la şobolani de exemplu, primele 7-10 zile cuprind etapa hematomului şi a inflamaţiei apărute post-fractură, iar aceste eta­pe prezintă o celularitate crescută pe preparatele histologice⁽⁶⁾. La două săptămâni post-fractură, calusul moale, fibros, ajunge la volumul maxim⁽⁷⁾. Urmează pro­ce­sul de proliferare, în urma căruia condrocitele devin hi­per­trofice, eliberează calciu şi suferă apoptoză, astfel încât după 10-14 zile de la formarea calusului moale începe şi osificarea endocondrală. Sintetic, pu­tem afirma că la 4 săptămâni încă vorbim de calus fi­bro­car­tilaginos, predominant fibros, iar perioada ur­mă­toare, până la 6 săptămâni, cuprinde procesul de for­mare a calusului condrohialin⁽⁶⁾. La 8-16 săptămâni post-fractură putem vorbi despre vindecare⁽⁷⁾. Asemănările exis­tente în biologia ţesutului osos între osul uman şi cel de şobolan au determinat alegerea şobolanilor ca modele ex­pe­ri­mentale pentru studierea modificărilor induse de statine⁽⁸⁾.

Statinele reprezintă tratamentul standard pentru toţi pacienţii cu risc înalt de boală cardiovasculară⁽⁹⁾. Fiind agenţi antiresorbtivi şi anabolici în acelaşi timp, sta­ti­nele joacă un rol foarte important în managementul clinic al osteoporozei şi al calusării, prin mai multe me­ca­nisme, printre care proliferarea, diferenţierea şi pro­tec­ţia osteoblaştilor, iar pe de altă parte, prin reducerea osteo­clastogenezei⁽¹⁰⁾. Aceste acţiuni asupra osului se numesc efecte pleotropice⁽¹¹⁾.

Asocierea strânsă a lipidelor cu depunerea mineralelor a fost bine stabilită. Studiile din literatura de specialitate au indicat că lipidele, în special fosfolipidele, joacă un rol important în reglarea mineralizării biologice. Ca prin­cipali constituenţi ai membranei celulare, lipidele men­ţin viabilitatea celulară, interacţionează cu pro­tei­nele membranei şi ajută la reglementarea fluxului io­nic transcelular. Drept componente ale matricei ex­tra­ce­lulare, acestea se găsesc sub formă de complexe de acizi fosfolipidici şi proteolipide, fiind intim asociate cu pro­mo­varea mineralizării^(12-13).

Calcificarea cartilajului s-a dovedit a fi un model excelent pentru a examina rolul lipidelor în mineralizare încă de la începutul procesului de depunere a hidro­xi­apa­titei⁽¹⁴⁾. Ţesutul osos mineralizat în sine conţine, de ase­menea, cantităţi mici de lipide, care ar putea juca un rol important în fiziologia osoasă⁽¹⁵⁾.

Studiul actual a urmărit să investigheze, la nivel mo­lecular, efectele tratamentului cu simvastatină asu­pra procesului de calusare la şobolani, utilizând spec­tro­scopia în infraroşu cu transformare Fourier (FT-IR), metodă inovatoare ce oferă informaţii despre mo­di­ficările compoziţionale şi conformaţionale de la ni­vel macromolecular, putând fi eficientă în rezolvarea con­tro­verselor cu privire la efectele moleculare ale sim­va­sta­tinei asupra ţesutului osos.

Spectroscopia FT-IR este o tehnică analitică standard de măsură care permite analiza rapidă a unei game largi de ţesuturi biologice⁽¹⁶⁾. În ultimul deceniu, tehnica a demonstrat un potenţial considerabil ca instrument de analiză avansată a probelor biologice, bazată pe am­prenta metabolică a acestora⁽¹⁷⁾. Metoda măsoară ab­sorbţia radiaţiei infraroşii în interacţiune cu vibraţiile legăturilor chimice din molecule, rezultând din tranziţii între nivelurile de energie de vibraţie. Celălalt avantaj al acestei tehnici este că poate detecta modificări foarte mici ale lungimilor şi unghiurilor dintre legăturile chimice ale unor molecule-ţintă din ţesuturile de interes. Acestea sunt sensibile la administrarea de medicamente sau la dezvoltarea de patologii ale subiecţilor şi nu sunt uşor detectabile folosind metodele morfologice clasice. Ca domeniu de cercetare emergent, un număr semnificativ de studii FT-IR au fost efectuate pe ţesuturi precum ficat, creier, muşchi şi ţesuturi osoase mineralizate⁽¹⁸⁾.

Materiale şi metodă

Studiul a fost efectuat pe un lot de 12 şobolani, îm­păr­ţit în două grupuri: şobolani neovarectomizaţi fără tratament, grup-martor (12 şobolani), respectiv şobolani neovarectomizaţi trataţi cu simvastatină (12 şobolani). Fiecare şobolan a suferit o fractură mediodiafizară a femurului drept, care a fost fixată cu ajutorul unei tije în canalul medular femural, pentru a putea evidenţia efectul tratamentului cu simvastatină asupra procesului de calusare la 8 săptămâni după fractură. Având în vedere faptul că, în conformitate cu datele din literatură, finalizarea procesului de calusare este posibilă în săptămâna 8 post-fractură, am decis să urmărim evoluţia ponderii lipidelor saturate şi nesaturate, corelată cu ponderea structurilor proteice şi a tipurilor de minerale în cadrul celor două grupuri studiate.

Măsurătorile prin FT-IR s-au realizat în transmisie, utilizând un spectrometru Jasco 6200. Pentru aceasta, 10-15 mg de fragment de calus osos femural au fost incluse prin mojarare în 200 mg de KBr (bromură de potasiu). Pulberea rezultată a fost compactată într-un disc cu diametrul de aproximativ 0,5 mm cu ajutorul unei prese manuale. Pentru o mai bună compactare, aerul a fost eliminat folosind o pompă de vid. Pentru măsurători s-a folosit o probă-etalon preparată în acelaşi fel, dar fără fragment de calus. Domeniul de măsură – numărul de undă a fost cuprins între 4000 cm^-1 şi 350 cm^-1. După fiecare măsurătoare, pentru fiecare spectru, s-a făcut corecţia liniei de bază.

Pentru analiză, s-a măsurat separat o probă de para­fi­nă, iar semnalul parafinei a fost extras numeric (folosind în acest scop un program scris în MathCad) din fiecare mă­surătoare. În programul MathCad s-au selectat trei do­me­nii de interes: i) pentru semnalul lipidelor (2800-3050 cm^-1); ii) pentru semnalul proteinelor (1400-2000 cm^-1) şi iii) pentru semnalul mineralelor (800-930 cm^-1). Pentru analiza detaliată a benzilor de absorbţie asociate cu cantitatea de lipide nesaturate, cu legăturile C-H asimetrice din CH₃, cu legăturile C-H asimetrice din CH₂, cu legăturile C-H simetrice din CH₂, Amida I, Amida II, şi cu cantitatea mineralelor (v4 PO₄^3-, v2 CO₃^2-), fiecare subspectru a fost supus procedurilor de deconvoluţie şi s-au măsurat ariile integrale. Pentru asocierea benzilor de absorbţie cu componentele organice sau anorganice a matricei osoase, s-au folosit datele din lucrarea scrisă de Sebnem Garip şi Feride Servercan⁽¹⁹⁾.

Rezultate

Tratamentul hipolipemiant are ca efect, pentru sem­na­lul înregistrat în intervalul 2975-3050 cm^-1, creşterea semnificativă a cantităţii de lipide nesaturate de la ni­velul matricei organice a ţesutului osos, aceasta având în cazul tratamentului cu simvastatină o valoare aproape dublă faţă de lotul-martor (figurile 1.1.a şi 1.2.a). În ceea ce priveşte grăsimile cu vibraţie asimetrică a legăturilor trivalente ale atomilor de carbon CH₃, pentru semnalul înregistrat în intervalul 2935-2975 cm^-1 se înregistrează o scădere semnificativă a acestora în cazul lotului tratat cu simvastatină (figurile 1.1.a şi 1.2.a).

În ceea ce priveşte vibraţia simetrică şi asimetrică a legăturilor bivalente ale atomilor de carbon CH₂ din structurile lipidice aso­ciate unor structuri proteice, acizilor nucleici sau car­bo­­hi­draţilor, pentru semnalul înregistrat în intervalul 2800-2975 cm^-1, în lotul cu tratament hipolipemiant s-a înregistrat o creştere a cantităţii acestor structuri (figurile 1.1.a şi 1.2.a).

În cazul lotului tratat cu simvastatină, structurile proteice de la nivelul matricei organice a ţesutului osos au înregistrat o dublare a cantităţii Amidei I şi o creştere de aproape şase ori a Amidei II (figurile 1.1.b şi 1.2.b).

Cantitatea de minerale de la nivelul calusului a fost influenţată de modificarea matricei organice, astfel înregistrându-se o creştere a cantităţii de fosfaţi la lotul cu tratament hipolipemiant. În ceea ce priveşte cantitatea de carbonaţi, faţă de lotul-martor, aceasta a înregistrat o scădere în cazul lotului tratat cu simvastatină (figurile 1.1.c şi 1.2.c).

Concluzii

Tratamentul hipolipemiant nu infuenţează doar componenta lipidică a matricei organice a ţesutului osos, ci şi componenta proteică a acesteia, iar aceste modificări ale matricei organice vor influenţa şi gradul de mineralizare a matricei organice. În ceea ce priveşte raportul dintre carbonaţi şi fosfaţi, modificarea acestuia poate influenţa duritatea/casabilitatea osului.

Scăderea cantităţii de carbonaţi poate fi corelată cu scăderea cantităţii de lipide saturate, iar creşterea can­ti­tăţii de fosfaţi, cu creşterea cantităţii structurilor ce pre­zentau vibraţia simetrică a legăturilor bivalente ale ato­mi­lor de carbon din structurile lipidice asociate unor struc­turi proteice, acizilor nucleici sau carbohidraţilor.

Tratamentul cronic pentru diverse comorbidităţi, de cele mai multe ori, trece neobservat atunci când se realizează reducerea şi imobilizarea unei fracturi, însă medicul de familie cunoaşte medicaţia cronică a pa­cien­tului şi poate corela diversele vicii de calusare cu această me­dicaţie. Pe baza acestor informaţii, durata imobilizării post-fractură poate fi ajustată, astfel încât şansele de recuperare să fie mai bune.   

Conflict of interests: The authors declare no con­flict of interests.