CERCETARE FUNDAMENTALĂ

Rolul antioxidanţilor neenzimatici în diminuarea stresului oxidativ asociat creşterii şi dezvoltării tumorilor maligne

 The role of non-enzymatic antioxidants in decreasing oxidative stress associated with the growth and development of malignancies

First published: 24 aprilie 2015

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/OnHe.31.2.2015.4267

Abstract

The active species of oxygen are produced as a result of normal aerobic metabolism. Of these, free radicals are usually remetabolized or inactivated in vivo by whole team of antioxidants. Individual team members of the antioxidant fight are specialized to prevent ROS generation by destroying the oxidative potential or capture them. In physiological conditions, tissue attack induced by the oxidative stress is minimal. A relative deficiency or absolute in antioxidant defenses can cause increased oxidative stress, and this event is associated with both causes and consequences of some diseases, including cancer. The purpose of this paper is to identify the role of antioxidant defense systems and diminishing oxidative stress in the dynamic growth and development of malignancies. Our study in vivo was held on Wistar rats bearing Walker 256 carcinoma, receiving non-enzymatic antioxidants vitamin C, vitamin A, Zn and arginine in various combinations. Treatment was initiated three weeks before tumor induction.

Keywords
non-enzymatic antioxidants, arginine, oxidative stress, malignancies, carcinoma Walker 256

Rezumat

Speciile active ale oxigenului sunt produse ca o consecinţă a metabolismului aerobic normal. Dintre aceştia, radicalii liberi sunt de obicei remetabolizaţi sau inactivaţi in vivo de o întreagă echipă de antioxidanţi. Membrii individuali ai echipei de luptă antioxidantă sunt specializaţi pentru a preveni generarea ROS, de a distruge potenţialul oxidant sau de a-i capta. În condiţiile fiziologice, atacul tisular indus de stresul oxidativ este minim. O deficienţă relativă sau absolută în apărarea antioxidantă poate determina creşterea stresului oxidativ, şi acest eveniment este asociat atât cauzelor, cât şi consecinţelor unor patologii, incluzân­du-se aici şi cancerul. Scopul lucrării este de a identifica rolul sistemelor antioxidante de apărare şi diminuare a stresului oxidativ în dinamica creşterii şi dezvoltării tumorilor maligne. Studiul nostru in vivo s-a desfăşurat pe şobolani Wistar purtători de carcinosarcom Walker 256 trataţi cu antioxidanţi neenzimatici vitamina C, vitamina A, Zn şi arginină în diferite combinaţii. Tratamentul a fost iniţiat trei săptămâni înainte de inducerea tumorii.

Introducere

Rolul speciilor reactive ale oxigenului şi al radicalilor liberi în patologia umană este astăzi unanim admis. Interesul comunităţii ştiinţifice de specialitate pentru reacţiile în care apar specii reactive ale oxigenului (SRO) este susţinut nu numai de numărul mare de procese în care apar, ci şi de diversitatea absolut surprinzătoare a acestora. SRO se formează constant în celule în diferite procese metabolice, sursele de formare fiind fie endogene, fie exogene. Medicamentele, radiaţiile UV, aerul poluat, agenţi chimici pot induce supraproducţia de SRO în celule(1).

Producerea de metaboliţi activi ai oxigenului este un proces fiziologic care creşte în intensitate odată cu vârsta, inflamaţia, bolile infecţioase, expunerea la radiaţii, poluanţi chimici, mod/stil de viaţă, acut sau cronic, pe o durată de timp mai lungă.

Odată formate, SRO sunt rapid descompuse de către sistemele antioxidante enzimatice şi neenzimatice existente în celule. Atunci când acestea sunt depăşite de producerea în exces a speciilor active, apare aşa-numitul stres oxidativ, noţiune fundamentată de cercetători din SUA, Anglia, Germania (B Ames(2), B. Halliwell(3), H. Sies(4)), stres care trebuie privit ca un dezechilibru dinamic şi care poate fi definit ca o modificare patologică produsă sub acţiunea unui flux puternic de metaboliţi activi ai oxigenului, determinată de un dezechilibru între sistemele de producere ale acestora şi cele de protecţie antioxidantă endogenă.
 

Figura 1. Carcinomul Walker 256. Tumora este bine vascularizată, cu vase dilatate în apropierea nume
Figura 1. Carcinomul Walker 256. Tumora este bine vascularizată, cu vase dilatate în apropierea nume

Cu alte cuvinte, pentru a putea cuprinde complexitatea fenomenelor ce implică intervenţia antioxidanţilor, Halliwell şi Gutterige au propus următoarea definiţie(5): „antioxidantul este orice substanţă a cărei prezenţă în cantităţi mici comparativ cu un substrat oxidabil întârzie semnificativ sau previne oxidarea substratului respectiv”. Termenul „substrat oxidabil” include orice tip de moleculă care există în organismele vii. Definiţia evidenţiază importanţa „leziunii-ţintă” studiate şi a sursei de specii reactive folosite atunci când se cercetează acţiunea antioxidanţilor in vitro.

Organismul sănătos reacţionează cu o mare eficienţă la producerea SRO, datorită sistemului biologic antioxidant apărut pe scara evolutivă a vieţuitoarelor de la bacterii chiar, fapt dovedit ştiinţific şi care a fundamentat importanţa metaboliţilor activi ai oxigenului în viaţa organismelor(6).
 

Figura 2. Valorile peroxizilor lipidici determinate în dinamica tratamentului cu antioxidanţi şi ind
Figura 2. Valorile peroxizilor lipidici determinate în dinamica tratamentului cu antioxidanţi şi ind
Figura 3. Valorile tiolilor totali măsuraţi în serul animalelor purtătoare de tumori
Figura 3. Valorile tiolilor totali măsuraţi în serul animalelor purtătoare de tumori


Sistemul biologic antioxidant include sisteme enzimatice şi neenzimatice endogene capabile să capteze sau să descompună metaboliţii reactivi ai oxigenului. Studiile epidemiologice relevă că persoanele care consumă o dietă bogată în vitamina E, b-caroteni şi vitamina C prezintă un risc scăzut de cancer sau alte afecţiuni asociate SRO, comparativ cu cei care au o alimentaţie deficitară în aceste vitamine. Efectul benefic se instalează însă când dieta conţine o varietate de antioxidanţi, şi nu numai cantităţi mari din cele mai sus-menţionate(7,8).
 

Figura 4. Concentraţia antioxidanţilor totali măsurată prin reacţia de oxido-reducere a fierului
Figura 4. Concentraţia antioxidanţilor totali măsurată prin reacţia de oxido-reducere a fierului


 

Figura 5. Valorile peroxizilor lipidici în dinamica creşterii tumorale, determinate din omogenat tis
Figura 5. Valorile peroxizilor lipidici în dinamica creşterii tumorale, determinate din omogenat tis


 

Figura 6. Nivelul tiolilor înregistrat în ţesutul tumoral
Figura 6. Nivelul tiolilor înregistrat în ţesutul tumoral


 

Figura 7. Valorile antioxidanţilor totali în ţesutul tumoral în dinamica creşterii tumorilor experim
Figura 7. Valorile antioxidanţilor totali în ţesutul tumoral în dinamica creşterii tumorilor experim
Lucrarea de faţă urmăreşte modularea activităţii endogene antioxidante cu ajutorul unor compuşi cu acţiune antioxidantă a producerii speciilor reactive de oxigen asociate creşterii şi dezvoltării tumorilor maligne.

Materiale şi metode

Materialul biologic a cuprins şobolani Wistar albino - obţinuţi din biobaza institutului, îngrijiţi şi hrăniţi cu alimentaţie standard care asigură toate elementele nutritive de care au nevoie rozătoarele. Se urmăresc zilnic astfel încât în loturile experimentale să fie introduse numai animale sănătoase şi care să aibă caracteristici asemănătoare (sex, greutate, vârstă) pentru omogenitatea lotului. Conform principiilor şi normelor eticii în cercetarea ştiinţifică experimentală, loturile sunt astfel alese încât să se reducă la maximum numărul indivizilor, existând o justificare a acestora (principiul reducerii), iar manevrele efectuate sunt astfel alese încât să se reducă la minimum durerile provocate (principiul limitării durerii).

Studiile au fost efectuate pe animale purtătoare de tumori experimentale, carcinosarcomul experimental Walker 256(9). Varianta carcinomatoasă a tumorii, selectată pe parcursul pasajelor, este compusă din structuri celulare susţinute de un ţesut stromal format din fibre colagenice şi din reticulină. Tumora este bine vascularizată, cu vase dilatate în apropierea numeroaselor focare de necroză.

Varianta sarcomatoasă prezintă celule fuziforme înconjurate de fibre de reticulină şi colagen puţin numeroase. Componenta sarcomatoasă a tumorii are predilecţie pentru imediata vecinătate a suprafeţei de necroză.

Procentul de prindere a grefei tumorale este de 80-90% cu variaţii sezoniere. Priza tumorală variază cu vârsta şi sexul animalelor. Tumora Walker 256 întreţinută prin grefe subcutane la şobolani Wistar metastazează rar, iar invazia ganglionilor loco-regionali are loc în faza terminală a creşterii tumorii, când fenomenele de necroză tumorală sunt accentuate. Forma ascitică şi convertirea formei solide în formă ascitică pot fi menţinute prin pasaje seriate la şobolan.

Este o tumoră standard utilizată în screening-ul preclinic al substanţelor antitumorale, precum şi în diferite modele experimentale de chimio-radio-imunoterapie, dar şi în modele de metastazare ganglionară obţinute prin tehnica grefei deschise. De asemenea, tumora este utilizată pe scară largă ca model experimental de inducere a caşexiei la şobolan, sindromul de caşexie fiind cauza majoră de mortalitate în cancer.

Model experimental: Administrarea antioxidanţilor s-a făcut pe trei loturi de animale, comparativ cu lotul martor netratat, zilnic introduse în bolul alimentar, trei săptămâni înaintea grefei tumorale. Lotul 1 a fost tratat cu vitamina A 3.000 U.I./kg corp+vitamina C 1 g/70 kg corp, zinc 30 mg/kg corp, lotul 2, zinc - aceeaşi doză, lotul 3 a fost tratat cu vitamina A+vitamina C=Zn+arginină. Dozele administrate sunt cele echivalente organismului uman, calculate pe kilogram corp. S-au recoltat probe biologice constând din sânge integral şi ţesut tumoral la 5, 10, 15 zile de la administrare şi la 7, 14 şi 21 de zile de la inocularea celulelor tumorale pentru toate loturile investigate.

Parametrii biochimici investigaţi au fost: indicele de peroxidare lipidică, evaluat prin măsurarea concentraţiei malondialdehidei serice, produs final al degradării hidroperoxizilor lipidici, evaluat prin reacţia cu acidul 2-tiobarbituric(10), tiolii albuminici au fost măsuraţi prin metoda Schosinski(11) utilizând reactiv Ellman într-o reacţie măsurabilă spectrofotometric la 412 nm. Antioxidanţii totali se măsoară prin abilitatea serului de a reduce fierul(12). La pH scăzut, complexul Felll - tripiridil-s-triazina (Felll-TPTZ) este redus la forma feroasă, cu formarea unui nou complex care dezvoltă o culoare intensă albastră, măsurabilă, cu un maxim de absorbţie la 593 nm. Orice reacţie cu un potenţial redox pozitiv în condiţiile menţionate poate conduce la reducerea complexului Felll-TPTZ. Utilizându-se un exces de Fe, factorul limitativ al complexului Felll-TPTZ şi a formării culorii reprezintă abilitatea reducătoare a probei. Reacţia măsoară reducerea complexului ion feric-2,4,6-tri(2-piridil)-1,3,5-triazina (TPTZ) la un produs colorat, reacţia se monitorizează 4 minute, măsurându-se densitatea optică la 593 nm.

Rezultate şi discuţii

Se observă o scădere a reacţiei de peroxidare lipidică în timpul tratamentului cu antioxidanţi la toate loturile investigate faţă de cel martor. După încetarea administrării compuşilor exogeni s-a indus tumora experimentală, care a determinat creşterea ratei de formare a speciilor reactive de oxigen care au iniţiat reacţia de peroxidare lipidică. Aceasta creşte, rămânând în platou atunci când tumora ajunge la dimensiuni asociate zilei a 21-a de la grefa tumorală. Rămânerea în platou a valorilor crescute se asociază cu scăderea concentraţiei substratului de reacţie, şi anume acizii graşi polinesaturaţi. Compuşii exogeni administraţi zilnic în hrana animalelor până în momentul grefei nu au asigurat o protecţie antioxidantă şi în perioada creşterii şi dezvoltării tumorale. Cea mai mare protecţie este asigurată de complexul antioxidanţilor care conţin şi arginină.

În ceea ce priveşte evoluţia tiolilor, aceştia scad dinamica tratamentului şi cresc în timpul dezvoltării tumorii, fiind de aşteptat o asemenea variaţie (tumora fiind generatoare de stres oxidativ).

Spre sfârşitul experimentului, pe măsură ce are loc refacerea „depozitelor” din ficat, se produce creşterea accentuată a tiolilor din ser deoarece glutationul redus creşte foarte mult în tumori.

Se observă o păstrare în limite normale a nivelului antioxidanţilor totali în timpul administrării antioxidanţilor exogeni şi scăparea de sub supravegherea antioxidantă a stresului oxidativ în timpul creşterii şi dezvoltării tumorale.

Rezultatele obţinute în special la aceste determinări subliniază faptul că lotul 2, la care s-a administrat numai zinc, nu are reacţii antioxidante semnificativ crescute, sugerându-se faptul că asocierea zincului cu vitaminele C şi A, augmentată de arginină, poate activa defensiva antioxidantă şi diminua stresul oxidativ mult mai eficient.

Determinările parametrilor de stres oxidativ din ţesut tumoral

Ţesutul tumoral înregistrează o scădere constantă a peroxidării în dinamica dezvoltării tumorii pentru lotul martor şi o uşoară scădere pentru loturile tratate, sugerându-se insuficienţa administrării acestui tratament. Reacţia de peroxidare fiind o reacţie în lanţ, consumarea substratului indică această scădere, dar şi lipsa protecţiei antioxidante. Pericolul este reprezentat de faptul că speciile reactive ale oxigenului şi în special peroxizii se pot deplasa de la locul reacţiei şi pot iniţia alte reacţii la nivelul celulelor normale din ţesutul sănătos înconjurător. Afectând în special dublele legături din structura membranelor, acestea se pot modifica iniţial structural, apoi şi funcţional prin pierderea rigidităţii, membranele modificate devin mai fluide, exprimă pe suprafaţa lor receptori modificaţi şi au o altă antigenicitate de suprafaţă.

Grefa tumorală induce cu siguranţă un stres oxidativ semnificativ, astfel că era de aşteptat ca acesta să urmeze o linie ascendentă. Administrarea antioxidanţilor înainte cu trei săptămâni de grefare conferă probabil numai o protecţie limitată, insuficientă.

Concluzii

Se ştie că rezultatele testărilor in vivo nu sunt întotdeauna predictibile din cauza numeroşilor factori (uneori greu controlabili) ce pot influenţa experimentul: variabilitatea individuală, starea sistemelor enzimatice, starea patologică, unele procese inflamatorii ce pot interveni pe parcursul perioadei de testare, bioritmurile (se obţin diferenţe importante între testările efectuate primăvara-vara faţă de cele realizate toamna sau iarna).

Se poate aprecia că administrarea constantă a unor antioxidanţi ar putea fi benefică pentru organismul respectiv(13).

Rezultatele obţinute în această lucrare demonstrează rolul antioxidanţilor exogeni în diminuarea stresului oxidativ şi în special când aceştia sunt administraţi într-o combinaţie complexă care conţine vitamina A, vitamina C, zinc şi arginină. De asemenea, am demonstrat că tumora este inductoare de stres oxidativ, drept urmare diminuarea acestuia se poate face numai cu un aport crescut de antioxidanţi. Tratamentele în acest scop pot fi benefice pe o perioadă de timp mai lungă sau cu o concentraţie mai mare, dar cu o prudenţă calculată astfel încât aceşti antioxidanţi să nu depăşească limita benefică şi să devină pro-oxidanţi.

Deoarece mulţi agenţi oxidanţi sunt generaţi mai întâi în faza apoasă, antioxidanţii hidrosolubili pot fi consideraţi antioxidanţi de linia întâi. Pe de altă parte, antioxidanţii lipidici sunt mai eficienţi. Antioxidanţii de fază apoasă acţionează probabil ca scavengeri primari, reacţionând direct cu metaboliţii toxici ai oxigenului, formând compuşi mai stabili(14). În timp ce ei pot fi şi protectori faţă de peroxidarea lipidică, gradul de protecţie faţă de o anumită moleculă depinde de profunzimea părţii lipofile a moleculei respective, prin care aceasta este ancorată de membrana lipidică(15). La nivel celular există o cooperare sinergică a bioantioxidanţilor.

Studiile epidemiologice relevă că persoanele care consumă o dietă bogată în vitamina E, b-caroteni şi vitamina C prezintă un risc scăzut de cancer sau alte afecţiuni asociate SRO, comparativ cu cei care au o alimentaţie deficitară în aceste vitamine. Efectul benefic se instalează însă când dieta conţine o varietate de antioxidanţi, şi nu numai cantităţi mari din cele mai sus menţionate.  

Bibliografie

  1. E. Cross, B. Halliwell, Oxygen and human disease, Ann. Int. Med. 107, 526-546, 1987.
  2. B.N. Ames, Micronutrients prevent cancer and delay aging, Toxicol. Lett, 102, 5-18, 1998.
  3. J.E. Biaglow, J.B. Mitchell, K. Held, the importance of peroxide and superoxide in the X-ray response, Int. J. Rad. Onc. Biol. Phys. 22, 665-669, 1992.
  4. B.Halliwell, Antioxidant characterization Biochem. Pharmacol, 49, 1341-1348, 1995.
  5. Halliwell, B and Gutteridge, JMC. Free radical in biology and medicine. Third edition. Oxford university press. 1998. 
  6. H. Sies, M.E. Murphy, D. Dimerscio, P.S. Kaiser, Antioxidant vitamines and micronutrients, Cancer Res. Clin. Oncol, 4,116-119, 1990.
  7. W. Augustin, I. Wiswedel, H. Noacek, T. Reinheckel, O. Reichelt, role of endogenous and exogenous antioxidants in the defense against functional damage and lipid peroxidation. Moll. Cell. Biochem. 174, 199-209, 1997.
  8. R. Olinescu, Vitamine, minerale şi antioxidanţi pentru sănătatea noastră, Ed. Infomedica, pp. 59-80, 1997.
  9. Inácio CM, Dietz UA, Malafaia O, Ribas Filho JM, Nassif PA, Czeczko NG, Marcondes CA. Action of tacrolimus on Wistar rat kidneys implanted with Walker 256 carcinosarcoma. Acta Cir Bras. ;25(1):98-104, 2010.
  10. Janero D.R., Free Rad. Biol. Med. 9(6), 1990, 515-540, Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury Free Rad. Biol. Med. 9(6), 515-540, 1990.
  11. Romero, Fj et al. (1992) The reactivity of thiols and disulfides with different redox states of myoglobin. J. Biol. Chem. 267, 1680. 1992.
  12. Prassad K.N., Multiple dietary antioxidants enhance the efficacy of standard and experimental cancer therapies and decrease their toxicity , Integr. Cancer Ther., 3(4), 310-322. 2004
  13. Shargorodsky M, Debbi O, Matas Z, Zimlichman R. Effect of long-term treatment with antioxidants (vitamin C, vitamin E, coenzyme Q10 and selenium) on arterial compliance, humoral factors and inflammatory markers in patients with multiple cardiovascular risk factors. Nutr Metab, 7(1):55, 2010.
  14. C. Rose, A.M. Bode, Analysis of watwr-soluble antioxidants by high-pressure liquid-chromatography. Biochem. J. 306,101-105, 1995.
  15. M.G. Simic, DNA markers of oxidative proceses in vivo: relevance to carcinogenesis and anticarcinogenesis, Cancer Res. 54, 1918-1923, 1994.

Articole din ediţiile anterioare

REVIEWS | Ediţia 3 44 / 2018

Imunoterapia unor anumite tipuri de cancere – scurt review

Dr. Alexandru Grigorescu

Imunoterapia îmbunătăţeşte abilitatea sistemului imunitar de a elimina celulele canceroase. Există mai multe tipuri de imunoterapie şi fiecare ajut...

30 octombrie 2018
BASIC RESEARCH IN CANCER | Ediţia 4 49 / 2019

Monitorizarea statusului oxidativ la pacienţii cu melanom uveal în timpul tratamentului oncologic

Maria Alexandra Budirinca, Maria Iuliana Gruia, Gabriela Murgoi, Rodica ANGHEL

Melanomul uveal este cea mai frecventă malignitate primară a ochiului la adulţi. Se cunosc puţine date despre etiologia sa. Factorii de risc includ...

14 decembrie 2019
REVIEW | Ediţia 2 / 2016

Tiolii albuminici - potențiali markeri ai statusului oxidativ în cancer

Maria Iuliana Gruia, Andreea Mirica

Stresul oxidativ a fost asociat, pentru o lungă perioadă de timp, cu fiziopatologia cancerului și a altor boli. Speciile reactive generate în exces...

07 martie 2017