ORIGINAL PAPER

Efectele expunerii la alcool asupra ficatului  şi miocardului fetal

 The effects of alcohol exposure on the liver and fetal myocardium

First published: 16 iunie 2017

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Peri.1.2.2017.833

Abstract

Introduction. Alcohol consumption during pregnancy exposes the child to the possibility of developing a series of physical and neurobehavioral disorders, among which fetal alcohol syndrome (FAS). The objective of our study was to evaluate the morphologic effects of pre-gestational and gestational exposure to alcohol on the fetal liver and myocardium.
Materials and methods.  We tested our hypothesis using a quasi-experimental, cross-sectional, comparative morphological study. The sample included 30 fetuses from female gestating rats.
Results. In both exposure groups, alcohol was associated with histopathological changes in the fetal liver: important steatosis and congestion, and sharp-edged, hyperchromatic hepatocyte nuclei. Important capillary congestion was observed in the fetal myocardium.
Conclusions. Our study enhances current knowledge on FAS by comparing different exposure durations. Further studies are required to evaluate the exact causal pathways of action, in order to develop effective population-based prevention strategies. 
 

Keywords
pregnancy, alcohol, liver, myocardium

Rezumat

Introducere. Consumul de alcool în timpul sarcinii expune fătul la o serie de modificări fizice şi neurocomportamentale, printre care şi sindromul alcoolic fetal (SAF). Obiectivul acestui studiu a fost evaluarea efectelor expunerii pregestaţionale şi gestaţionale la alcool, din punct de vedere morfologic, la nivelul ficatului şi miocardului.
Materiale şi metode. Testarea ipotezei de cercetare s-a bazat pe un studiu morfologic cvasiexperimental, transversal, comparativ. Eşantionul din acest studiu a inclus 30 de feţi proveniţi de la femele gestante de şobolani.
Rezultate. Alcoolul administrat în ambele perioade de expunere a determinat la feţi modificări histopatologice la nivelul ficatului: steatoză marcantă, congestie evidentă, nuclei hepatocitari hipercromi, colţuroşi. La nivelul miocardului a fost observată congestia marcantă a capilarelor.
Concluzii. Studiul prezent îmbogăţeşte nivelul actual de cunoştinţe în domeniul sindromului alcoolic fetal. Sunt necesare mai multe studii pentru evaluarea mecanismelor de acţiune ale alcoolului, cu scopul de a dezvolta strategii de prevenire la nivel populaţional.

 

Introducere

Consumul de alcool în timpul sarcinii expune fătul la o serie de modificări fizice şi neurocomportamentale, printre care şi sindromul alcoolic fetal (SAF). Acesta este un sindrom congenital indus de expunerea fătului la alcool în perioada prenatală şi se caracterizează prin: întârziere a dezvoltării prenatale şi/sau postnatale, disfuncţii ale sistemului nervos central, retard mintal şi malformaţii cranio-faciale specifice sindromului(1).
Gravitatea sindromului şi debutul său depind în primul rând de vârsta gestaţională, cantitatea şi frecvenţa consumului, starea de sănătate a mamei, predispoziţia genetică a fătului şi a mamei, respectiv asocierea mai multor substanţe nocive(2). După consum, alcoolul străbate bariera placentară, ajungând în circulaţia fetală(3).
Alcoolul are o toxicitate importantă asupra organogenezei, mai ales în prima perioadă a sarcinii. În primul trimestru al sarcinii interferează cu migrarea şi dezvoltarea celulelor sistemului nervos central, fenomen care duce la malformaţii la acest nivel(4). În al treilea trimestru al sarcinii este afectat în primul rând hipocampul, o structură cu un rol important în memorie şi învăţare(5).
Obiectivul acestui studiu a fost evaluarea efectelor expunerii pregestaţionale şi gestaţionale la alcool, din punct de vedere morfologic, la nivelul ficatului şi al miocardului. Un obiectiv secundar a fost compararea efectelor în funcţie de durata expunerii, pentru a stabili dacă factorul temporal prezintă efecte cumulative. Importanţa acestui studiu constă în identificarea unor căi etiopatogenetice care să permită o mai bună înţelegere a acestei afecţiuni, aspect foarte important în dezvoltarea strategiilor de prevenire a SAF.

Materiale şi metode

Loturile de studiu
Testarea ipotezei de cercetare s-a bazat pe un studiu morfologic cvasiexperimental, transversal, comparativ. Eşantionul din acest studiu a inclus 30 de feţi proveniţi de la femele gestante de şobolani, rasa Wistar, cu greutate între 180 şi 200 g, în vârstă de 16 săptămâni, primipare provenite din Biobaza UMF „Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca, menţinute în condiţii de vivarium adecvate, la Biobaza Disciplinei de Fiziologie.
Pentru studiu s-a obţinut Acordul Comisiei de Etică nr. 438/24.07.2016,  aprobat de UMF „Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca. Experimentele au fost efectuate în Laboratorul de Cercetări Experimentale din cadrul Departamentului de Fiziologie al aceleiaşi universităţi. 
Loturile de feţi (10 şobolani în fiecare lot) proveniţi de la animale femele gestante au fost împărţite astfel:
  • Lotul I - martor, feţi rezultaţi de la femele cărora nu li s-a administrat alcool.
  • Lotul II - feţi rezultaţi de la femele la care s-a administrat alcool timp de 20 de zile pe perioada gestaţiei.
  • Lotul III - feţi rezultaţi de la femele la care s-a administrat alcool timp de 50 de zile (30 de zile pregestaţie şi 20 de zile pe durata gestaţiei).

Tehnica de studiu

Administrarea alcoolului s-a făcut prin gavaj oro-faringian: alcool etilic 30% în doză de 2 ml/kg corp/zi - echivalentul a 3 sticle de bere (500 ml) şi 1 pahar de vin la un adult de 60 kg(6).
Durata administrării a fost de 20 de zile, având în vedere că durata unei sarcini normale la termen este de 20 de zile la şobolani. Pentru expunerea în pregestaţie, s-a ales un interval de 30 de zile, pentru a simula o administrare cronică înainte de sarcină - echivalentul unui an înainte de sarcină la om.
Pregătirea animalelor pentru gestaţie s-a făcut după metoda Ladoşi, adaptată pentru rozătoare: gonadotropină serică bovină (PMSG) - fiole de 600 UI pentru stimulare foliculară; gonadotropină corionică (hCG), fiole de 1500 UI, pentru inducerea ovulaţiei, produs administrat la 48 de ore după PMSG. Fecundarea s-a produs cu ajutorul unui mascul introdus la femele, după 24 de ore de la administrarea hCG.
Extragerea feţilor s-a realizat în ziua a 20-a de gestaţie, prin operaţie cezariană de la femele anesteziate cu Ketamină - Xilazină (2:1) 0,1 ml/100 g/corp. Recoltarea ţesuturilor de la feţi (ficat şi miocard) s-a efectual în vederea analizei histopatologice. La terminarea experimentului, animalele au fost eutanasiate cu supradoză de Ketamină 10%.

Analiza histopatologică

Fetuşii au fost prelevaţi şi conservaţi în formol până la efectuarea examenului necropsic. Aceştia au fost secţionaţi longitudinal pe linia sagitală şi s-a realizat examinarea macroscopică a organelor. Probele au fost recoltate conform recomandărilor Societăţii Europene de Patologie Toxicologică (ESTP).
Probele recoltate, reprezentate de ficat şi miocard, au fost introduse în soluţie de formol tamponat, neutru 10%, în vederea fixării. După fixare, în vederea efectuării examenului histopatologic, probele au fost prelucrate după tehnica la parafină. S-au efectuat secţiuni seriate la o grosime de 4 micrometri cu ajutorul microtomului Leica RM 2125 RT, secţiunile fiind etalate pe lame histologice uzuale pentru examenul histopatologic, prin colorarea hematoxilină-eozină. Protocolul urmat pentru coloraţia (hematoxilină şi eozină) H&E a fost următorul: deparafinarea probelor, prin introducerea în două băi de xilen timp de 3 minute, hidratarea probelor în 3 băi succesive de alcool etilic (100% - 3 minute, 90% - 3 minute şi 70% - 3 minute), urmate de imersarea în apă distilată. 
În continuare, probele au fost introduse în hematoxilină Gill 2 timp de 2 minute, spălate într-o baie de apă de robinet timp de 3 minute, imersate în soluţie de eozină-floxină timp de un minut şi spălate în apă de robinet. Apoi s-a procedat la deshidratarea probelor în 3 băi succesive de alcool etilic (70% - 3 minute, 90% - 3 minute şi 100% - 3 minute), clarificarea prin imersarea în xilen timp de 3 minute, de două ori, şi în final montarea (în mediu de montare), urmată de examinarea la microscop. 
Preparatele au fost examinate cu ajutorul unui microscop Olympus BX 41, iar imaginile au fost preluate cu o cameră digitală Olympus UC325 şi prelucrate cu ajutorul programului de achiziţie şi prelucrare de imagini Olympus Stream Basic.
 
Figura 1. Ficat, lot-martor, aspect histologic normal, caracteristic acestui stadiu de dezvoltare, HE x400
Figura 1. Ficat, lot-martor, aspect histologic normal, caracteristic acestui stadiu de dezvoltare, HE x400
 
Figura 2. Ficat, lot expunere gestaţie: uşoară congestie a capilarelor sinusoide, vacuolizarea moderată a hepatocitelor; HE x400
Figura 2. Ficat, lot expunere gestaţie: uşoară congestie a capilarelor sinusoide, vacuolizarea moderată a hepatocitelor; HE x400
 
Figura 3. Ficat, lot expunere pregestaţie-gestaţie: steatoză marcantă, congestie evidentă, nuclei hepatocitari hipercromi, colţuroşi; HE x400, bară=50 µm
Figura 3. Ficat, lot expunere pregestaţie-gestaţie: steatoză marcantă, congestie evidentă, nuclei hepatocitari hipercromi, colţuroşi; HE x400, bară=50 µm
 
Figura 4. Miocard, lot expunere gestaţională: uşoară vacuolizare  a fibrelor miocardice; HE x400
Figura 4. Miocard, lot expunere gestaţională: uşoară vacuolizare a fibrelor miocardice; HE x400
 
Figura 5. Miocard, lot expunere pregestaţie-gestaţie: congestia marcantă a capilarelor; HE x400
Figura 5. Miocard, lot expunere pregestaţie-gestaţie: congestia marcantă a capilarelor; HE x400


Rezultate

În ceea ce priveşte modificările hepatice, la lotul-martor morfologia macro- şi microscopică a ficatului a fost una normală, în citoplasma hepatocitelor fiind prezente fine vacuole lipidice şi de glicogen, iar în parenchim s-a observat prezenţa unor focare de eritropoieză extramedulară (figura 1).
La animalele din ambele loturi tratate cu alcool s-a observat o creştere marcantă a cantităţii de lipide din citoplasma hepatocitelor fetale, acestea fiind hipertrofiate, având citoplasma intens vacuolizată, severitatea leziunilor fiind mai mare la lotul la care s-a administrat alcool 50 de zile. În lotul de expunere pregestaţie-gestaţie se observă, de asemenea, fenomene de eritropoieză extramedulară (figura 2).
De asemenea, se observă dilatarea capilarelor sinusoide şi atrofierea venelor centrolobulare. Majoritatea nucleilor hepatocitari au fost hipercromi, colţuroşi (cariopicnoză), fenomenul fiind mai evident în cazul feţilor proveniţi de la femele care au primit alcool 50 de zile (figura 3).    
În ceea ce priveşte modificările de la nivel cardiac, nu s-au observat defecte septale atriale sau ventriculare la niciun animal luat în studiu. 
Referitor la histologia miocardică, la animalele repartizate în lotul-martor morfologia fibrelor miocardice a fost una normală. 
În cazul animalelor cărora li s-a administrat alcool pe perioada gestaţiei (20 de zile), morfologia miocardică a fost similară cu cea a lotului-martor, singura leziune evidentă fiind o uşoară vacuolizare a fibrelor miocardice (figura 4).
La animalele supuse efectelor alcoolului o perioadă lungă - pregestaţie (30 de zile) şi gestaţie (20 de zile) - s-a observat congestia evidentă a capilarelor miocardice şi prezenţa unor vacuole în citoplasma celulelor de la acest nivel (figura 5).

Discuţii 

Atât la nivel ficatului, cât şi la nivelul miocardului au fost observate efecte semnificative asupra organogenezei fetale, după administrarea cronică a alcoolului. Acest fenomen este important, deoarece modelul animal ales are valoare comparativă documentată în literatură pentru studiul FAS(9). 
Deşi recomandările referitoare la consumul de alcool pentru femeile însărcinate recomandă abstinenţa totală în perioada sarcinii(10), studiul actual pune în evidenţă efectele cumulate pe care le aduce consumul cronic.
Deşi există un număr mare de publicaţii care studiază efectele consumului matern asupra defectelor congenitale ale inimii, concluziile acestora nu sunt consistente(11). În concordanţă cu o metaanaliză pe această temă publicată în 2011, expunerea loturilor de şobolani la alcool în perioadele de pregestaţie-gestaţie şi gestaţie nu a determinat anomalii congenitale ale cordului(12).
La nivel vascular, administrarea zilnică de alcool matern în timpul ultimului trimestru de sarcină induce modificări fetale, precum rigiditate arterială crescută, conform unui model experimental pe ovine(13). Similar, studiul nostru confirmă modificări la nivel de miocard, accentuate de consumul cronic.
Studii anterioare au arătat faptul că alcoolul etilic inhibă dezvoltarea hepatică şi inhibă activitatea enzimei ornitin decarboxilază la feţi. Având în vedere aceste aspecte, determinarea greutăţii hepatice ar putea fi un marker important în evaluarea toxicităţii hepatice a acestei substanţe(14). Pentru acest lot de şobolani, în contrast cu literatura de specialitate(15), nu s-a observat prezenţa icterului atribuit expunerii la alcool. 
SAF este o problemă de sănătate publică în evoluţie. La nivel socioeconomic, consumul de alcool în timpul sarcinii este atribuit sărăciei(7). Totuşi, în ultimii ani (2010-2015), acesta are o creştere constantă în ţările dezvoltate(8). Din acest motiv, sunt necesare studii suplimentare pentru evaluarea mecanismelor de acţiune ale alcoolului, cu scopul de a adapta strategiile de prevenire la nivel populaţional.
Deşi modelul de studiu prezintă anumite limitări, precum numărul limitat al lotului şi nivelul de analiză calitativ, studiul prezentat îmbogăţeşte nivelul actual de cunoştinţe în domeniul SAF prin analiza comparativă a timpului de expunere la alcool.

Concluzii

Alcoolul administrat la loturile de şobolani a determinat la feţi apariţia unor modificări morfologice semnificative la nivel hepatic şi modificări mici la nivelul miocardului. Alcoolul administrat în perioada pregestaţie-gestaţie la femele determină la feţi modificări histopatologice mai evidente decât dacă este administrat doar în perioada gestaţiei.   

Bibliografie

1. Popova S, Lange S, Probst C, et al. Estimation of national, regional, and global prevalence of alcohol use during pregnancy and fetal alcohol syndrome: a systematic review and meta-analysis. Lancet Glob Heal 2017; 5(3):e290–9. 
2. del Campo M, Jones KL. A review of the physical features of the fetal alcohol spectrum disorders. Eur J Med Genet 2017; 60(1):55–64. 
3. Joya X, Friguls B, Ortigosa S, et al. Determination of maternal-fetal biomarkers of prenatal exposure to ethanol: A review. J Pharm Biomed Anal 2012; 69:209–22. 
4. Abbott CW, Kozanian OO, Kanaan J, et al. The Impact of Prenatal Ethanol Exposure on Neuroanatomical and Behavioral Development in Mice. Alcohol Clin Exp Res 2016; 40(1):122–33. 
5. Coles CD, Goldstein FC, Lynch ME, et al. Memory and brain volume in adults prenatally exposed to alcohol. Brain Cogn 2011; 75(1):67–77. 
6. Kerr WC, Stockwell T. Understanding standard drinks and drinking guidelines. Drug Alcohol Rev 2012; 31(2):200–5. 
7. McKinney CM, Chartier KG, Caetano R, et al. Alcohol availability and neighborhood poverty and their relationship to binge drinking and related problems among drinkers in committed relationships. J Interpers Violence 2012; 27(13):2703–27. 
8. Lanting CI, van Dommelen P, van der Pal-de Bruin KM, et al. Prevalence and pattern of alcohol consumption during pregnancy in the Netherlands. BMC Public Health 2015; 15(1):723. 
9. D’Souza El-Guindy NB, Kovacs EJ, De Witte P, et al. Laboratory models available to study alcohol-induced organ damage and immune variations: choosing the appropriate model. Alcohol Clin Exp Res 2010; 34(9):1489–511. 
10. NHS, UK – Drinking Guidelines for Pregnancy and Breastfeeding. 
11. Yang J, Qiu H, Qu P, et al. Prenatal Alcohol Exposure and Congenital Heart Defects: A Meta-Analysis. Dastgiri S, editor. PLoS One 2015; 10(6):e0130681. 
12. Dolk H, Loane M, Garne E, et al. Congenital Heart Defects in Europe: Prevalence and Perinatal Mortality, 2000 to 2005. Circulation 2011; 123(8):841–9. 
13. Parkington HC, Kenna KR, Sozo F, et al. Maternal alcohol consumption in pregnancy enhances arterial stiffness and alters vasodilator function that varies between vascular beds in fetal sheep. J Physiol 2014; 592(12):2591–603. 
14. Meyers AFA, Gong Y, Zhang M, et al. Liver development in a rat model of fetal alcohol syndrome. Dig Dis Sci 2002; 47(4):767–72. 
15. Caputo C, Wood E, Jabbour L. Impact of fetal alcohol exposure on body systems: A systematic review. Birth Defects Res Part C Embryo Today Rev 2016; 108(2):174–80. 

Articole din ediţiile anterioare

CASE REPORT | Ediţia 1 2 / 2018

Prognosticul materno-fetal al sarcinii complicate cu ciroză biliară secundară – review al literaturii de specialitate şi prezentare de caz

Andreea Boiangiu, George Alexandru Filipescu, Georgiana Dinu, Prof. Dr. Radu Vlădăreanu, Simona Vlădăreanu

Managementul gravidei cu afectare hepatică reprezintă o adevărată provocare pentru echipa complexă formată din obstetrician, gastroenterolog, neona...

07 mai 2018
REVIEW | Ediţia 2 2 / 2018

Sarcină gemelară obţinută spontan versus sarcină gemelară obţinută prin FIV/ICSI – review al literaturii

Ana Maria Măreşescu, Simona Vlădăreanu, Silviana Mănăilă, Andreea Radu

Sarcina gemelară reprezintă o provocare pentru echipa medicală, dat fiind riscul crescut de complicaţii materno-fetale, fiind cea mai frecventă for...

23 iunie 2018
OBSTETRICS | Ediţia 4 1 / 2017

Utilizarea medicamentelor biologice pentru bolile autoimune în timpul sarcinii şi lactaţiei

Andreea Boiangiu, Andra Bălănescu, Prof. Dr. Radu Vlădăreanu

Bolile autoimune afectează cu precădere femeile de vârstă fertilă, punându-şi astfel amprenta asupra fertilităţii şi evoluţiei sarcinii şi având ef...

24 decembrie 2017
ORIGINAL PAPER | Ediţia 1 2 / 2018

Care este comportamentul româncelor privind fumatul şi consumul de alcool în timpul sarcinii?

Antoniu Crîngu  Ionescu, Alexandra Matei, Daniel Călin, Diana Gheorghiu, Bogdan Socea, Mihai Dimitriu

Deşi este arhicunoscut faptul că fumatul şi alcoolul au doar efecte nocive asupra sănătăţii, aceste obiceiuri afectează un procent important al pop...

07 mai 2018