Dintre sindroamele diagnosticate la speciile de psitacine PDD (proventricular dilatation disease sau proventricular dilatation syndrome), entitatea morbidă este cea care încă generează multe dispute între specialişti, atât ca diagnostic şi patogeneză, cât şi ca terapie sau posibilităţi de intervenţie medicală optime. PDD a fost descrisă de specialişti încă de acum peste 40 de ani, primind diferite denumiri: ganglioneurită mienterică, MWD - Macaw wasting disease -, boala fiind diagnosticată prima dată la juvenilii acestei specii, sindromul dilatării proventriculului sau proventriculita dilatativă a papagalilor. Boala evoluează cu focare inflamatorii localizate la nivelul nervilor unor organe-ţintă, determinând în timp incapacitatea funcţională a acestora. În cazul afectării compartimentului proventricular se constată incapacitatea enzimatică şi digestivă, alimentele nedigerate (sau nepregătite pentru digestie) trec în stomacul muscular şi apoi duodenal, unde se produc fermentaţii, formându-se compuşi ce accelerează tranzitul. Pasărea, deşi prezintă apetit şi consumă hrana, prezintă o stare de slăbire avansată, epuizare şi, după o perioadă relativ lungă, exitus. Proventriculul ajuns în incapacitate funcţională se dilată excesiv (vizibil radiografic), ca urmare a acumulării de alimente (acestea stagnează mai mult decât în stări clinice normale) şi a dezvoltării unor procese fermentative. Uneori este posibil ca boala să evolueze direct la nivel central, cu afectarea nervilor cranieni, pasărea prezentând stări convulsive, anomalii neurologice bruşte, cecitate, evoluţia bolii în aceste cazuri fiind mult mai scurtă, iar intervenţia terapeutică iluzorie. Conduita terapeutică folosită iniţial includea obligatoriu antiinflamatoare care asigurau stoparea evoluţiei (pentru anumite intervale mai scurte sau mai lungi), asigurând supravieţuirea păsării cu semne clinice stabile, dar persistente.
Lărgirea spectrului de specii de psitacine întreţinute în captivitate a permis constatarea că boala poate evolua la toate speciile de Ara spp. şi chiar la alte specii de papagali sau chiar de peruşi. Au început să fie semnalate cazuri la Psittacus erithacus, la specii de Platycercus spp. sau de Psittacula spp. Studii îndelungate au început să facă legătura între infecţiile cu bornavirusuri aviare şi PDD. Bornavirusurile animale şi umane erau deja studiate aprofundat pentru rozătoare (în special şobolani), pentru solipede (în special cele sălbatice sau resălbăticite), pentru primate (acolo unde a intervenit major în mediu populaţia umană), pentru suine (mai ales cele întreţinute în captivitate) şi pentru om. În perioada anilor 2000-2005 au fost demarate studii ample pentru bornavirozele aviare, în special concentrate pe speciile de păsări domestice din crescătorii şi mai ales pentru găină. În 2008 au fost izolate primele bornavirusuri la papagali şi s-a făcut pentru prima dată legătura între evoluţia şi patogeneza infecţiei cu bornavirus la păsările cu PDD. A fost avansată ipoteza că bornavirusul declanşează o reacţie autoimună, în urma căreia sistemul imunitar al păsării începe să atace ţesutul nervos, provocând leziunile tipice. Au fost efectuate studii tot mai ample care să demonstreze etiologia virală a PDD, cercetările efectuându-se atât pentru păsările din captivitate (prin intermediul crescătoriilor de psitacine sau al cabinetelor veterinare specializate), cât şi pentru păsări capturate din mediul natural. În mediul natural s-a constatat (evaluând câteva sute de exemplare) că păsările sunt pozitive pentru bornavirus în proporție de 22-23%, iar în cazul păsărilor din captivitate, procentul este mai mare, în unele crescătorii constatându-se că peste 35% din păsări sunt pozitive.
Studiile efectuate au demonstrat că există mai multe genotipuri de virus care afectează cu predilecţie anumite specii de papagali şi care determină un tablou lezional şi o evoluţie diferită. Până în prezent, cercetările efectuate încă nu au clarificat incidenţa fiecărui genotip în populaţiile de papagali şi nu au putut face o distincţie clară între un anumit genotip şi anumite specii de psitacine. Studiile statistice sunt relativ dificil de realizat, pentru că s-a constatat că acelaşi genotip poate fi izolat de la diferite specii (mai ales în cazul crescătoriilor cu mai multe specii de papagali, virusul se transmite indiferent de genotip la orice specie), iar în multe situaţii se izolează de la acelaşi individ două sau mai multe genotipuri. În plus, analiza de laborator relevă prezenţa virusului (în multe cazuri, rezultatul este redat ca bornavirus pozitiv) fără a face referire la genotip.
Analiza de laborator se face fie în scopul depistării prezenţei şi identificării virusului, fie în scopul depistării anticorpilor specifici. Diagnosticul de confirmare pentru bornavirus aviar pozitiv se realizează în prezent prin analiză a PCR, care relevă prezenţa virusului în probele biologice, dar nu certifică şi starea de boală. Mulţi papagali testaţi (din diferite specii) au fost depistaţi cu bornavirus pozitiv, fără a prezenta însă un tablou clinic sau lezional. În plus, analiza PCR relevă virusul fără a stabili genotipul exact al virusului depistat. Determinarea anticorpilor şi a titrului de anticorpi arată că sistemul imunitar al păsării reacţionează faţă de virusul care a pătruns în organism. Deşi s-a emis ipoteza că un titru mare de anticorpi sugerează infecţia şi încercarea organismului de a distruge virusul, cercetările clinice au relevat că papagalii pozitivi şi cu un titru foarte ridicat de anticorpi prezintă cel mai mare risc de a dezvolta PDD (la papagalii pozitivi cu titru mic de anticorpi nu a fost diagnosticat PDD nici după mai multe luni, perioadă în care pasărea nu s-a negativat).
În prezent sunt încadrate 7 genotipuri de bornavirus aviar care afectează diferite specii de papagali. Toate determină simptomatologie specifică şi se asociază cu PDD în diferite etape şi faze de evoluţie. Transmiterea virusului este posibilă atât pe orizontală, cât şi pe verticală. Studiile au demonstrat transmiterea fecal-orală, în special în crescătorii fiind constatată transmiterea rapidă a virusului pe această cale, fiind demonstrată infectarea păsărilor nou introduse în efectiv şi confirmate cu bornavirus negativ în maximum 6 zile de la expunere. În aproximativ 18 zile de la contaminare se constată că papagalii devin eliminatori de virus, în special prin fecale. Puii sunt mai sensibili, cercetările demonstrând că, în cazul părinţilor pozitivi, toţi puii din cuib devin pozitivi. Cercetări recente au demonstrat şi posibilitatea transmiterii virusului prin ou, deşi nu toate ouăle pontate de un bornavirus pozitiv sunt la rândul lor purtătoare de virus, ba chiar în unele situaţii s-a constatat că, deşi mama era pozitivă, ouăle au fost negative, sugerându-se posibilitatea ca, cel mai frecvent, puii să se contamineze după eclozare. A fost, de asemenea, stabilită şi posibilitatea de contaminare prin aerosoli, deşi aceasta este mai redusă, explicând transmisibilitatea bolii în crescătorii, unde păsările testate au fost negative (la testări repetate), iar la un moment dat a apărut infecţia.
Dintre genotipurile de bornavirus, genotipul II afectează în special peruşii nimfă (Nymphicus hollandicus), generând manifestări clinice cu simptomatologie severă şi o evoluţie rapidă a bolii. Genotipul IV este cel mai frecvent incriminat în dezvoltarea PDD la toate speciile de psitacine, fiind şi genotipul cel mai des izolat. Toate genotipurile folosesc aceeaşi cale de contaminare şi apoi de multiplicare activă. Există diferenţe de patogeneză între bornavirusurile aviare şi cele mamifere. Bornavirusurile aviare pătrund într-o celulă de contact, unde determină nucleul să funcţioneze în sensul obţinerii acizilor nucleici necesari transcrierii şi replicării genomului viral. Celula gazdă este foarte puţin afectată, astfel că sistemul imun al păsării nu reacţionează. Urmează o fază de diseminare în organism, în care virusul părăseşte celula gazdă şi se integrează celulelor din alte ţesuturi şi organe, calea de migraţiune preferată fiind traseele nervoase periferice şi uneori chiar sistemul nervos central (migrând pe traseul medular până în zona cerebrală). Uneori se cantonează în SNC şi de acolo se va răspândi periodic în organism pentru tot restul vieţii păsării. Alteori se integrează plexurilor nervoase şi se cantonează în ţesuturi şi organe ale tractusului digestiv (în special în proventricul, mai rar în pipotă şi ficat) sau în rinichi, pulmoni şi cord.
Mulţi indivizi dezvoltă PDD sau simptomatologie nervoasă şi digestivă. În această fază, diagnosticul poate fi stabilit pe baza testelor de sânge (PCR pozitiv pentru bornavirus aviar sau anticorpi antivirali specifici). Diagnosticul clinic al PDD este greu de stabilit pe baza simptomatologiei, deoarece multe simptome apar în multe alte boli infecţioase, parazitare sau metabolice. Diagnosticul de PDD se confirmă pe baza leziunilor digestive specifice (în special leziunile proventriculare), completate cu examene histologice pe probe recoltate din proventricul, pipotă, rinichi, creier şi măduva spinării.
Materiale și metode
Am efectuat un studiu care a inclus 54 de psitacine din specii încadrate taxonomic în diferite genuri: 6 Amazona aestiva, un Amazona ventralis, 7 Ara ararauna, 4 Ara macao, 12 Psittacus erithacus, 2 Cacatua galerita, un Cacatua alba, 2 Cacatua sulphureus, un Pionis menstruus, 2 Pionites leucogaster, 11 Psittacula krameri, 5 Psittacula eupatria. Distribuţia pe sexe a fost de 31 de masculi şi 23 de femele. Vârsta a variat între mai puţin de 1 an şi 17 ani, fiind necunoscută şi greu de apreciat pentru 7 păsări. Din totalul păsărilor incluse în acest studiu au fost trimise pentru necropsie 9, recoltându-se probe biologice post-mortem, în timp ce la alte 12 păsări au fost recoltate probe prin biopsie. Toate păsările au prezentat semne clinice ale PDD, manifestările fiind centrate pe tractusul digestiv (greutatea corporală redusă, diaree, alimente nedigerate în fecale sau proventricul dilatat), unele păsări prezentând şi simptomatologie consecutivă afectării sistemului nervos (tremor, ataxie sau convulsii).
Diagnosticul a fost stabilit prin PCR. A fost obţinut un standard PCR care conţine SDC cu secvenţa-ţintă C, în urma clonării secvenţei-ţintă într-un vector, cu ajutorul unui kit de clonare Topo TA, cu promotor dublu, respectând instrucţiunile producătorului. Materialul genetic a fost extras cu ajutorul unui kit de minipreparate SNAP, în funcţie de instrucţiunile producătorului. Concentraţia materialului genetic a fost determinată prin spectrofotometrie, cu ajutorul dispozitivului Gene Quant II RNA/DNA, iar RNA-ul a fost utilizat ca şablon pentru testul PCR SDC-C, în vederea confirmării prezenţei secvenţei C a SDC pentru C. jejuni. Standardele au fost obţinute din preparatele conţinând între 1,2 şi 1,2 x 108 echivalenţi de genom per 3 µl de etalon de material genetic, acestea fiind stocate la -20oC, decongelate şi congelate de maximum trei ori înainte de utilizare. Primerii PCR şi probele (CJTP2) au fost elaborate cu ajutorul software-ului Primer Express, în vederea direcţionării spre regiunea specifică.
Metoda de analiză RT-PCR a fost pusă în practică într-un volum de 25 µl, conţinând reactiv PCR Universal TaqMan; primerii (cu concentraţie finală de 300 nM), proba pregătită anterior (cu concentraţie finală de 300 nM) şi o cantitate de 3 µl de etalon material genetic. Condiţiile realizării ciclurilor termice au fost următoarele: 50oC timp de 2 minute, 95oC timp de 10 minute, 45 de cicluri la 95oC timp de 15 secunde şi 60oC timp de 1 minut. Ciclurile termice, colectarea datelor obţinute pe baza fluorescenţei şi analiza acestora au fost realizate cu ajutorul sistemului de detecţie secvenţială ABI Prism 7700, respectând cerinţele producătorului. Reactivii TaqMan Universal PCR conţin o soluţie colorantă pasivă ca punct de referinţă faţă de care se realizează normalizarea soluţiei colorante de raport în timpul analizei datelor. Acest aspect permite corecţia fluctuaţiilor în fluorescenţă datorate modificărilor de concentraţie şi volum ale amestecului de reacţie. Toate soluţiile colorante prezente în tehnica PCR 5’nuclează contribuie la spectrele fluorescente, generând o suprapunere a spectrului compus. Sistemul de detecţie analizează aceste multiple componente prin monitorizarea frecvenţei emisiilor specifice soluţiei colorante. Normalizarea soluţiei colorante etalon a fost realizată prin divizarea intensităţii emisiei sale cu intensitatea soluţiei colorante pasive de referinţă, în vederea obţinerii unui raport definit ca Rn (raportor normalizat) pentru o reacţie dată. Rn + reprezintă valoarea Rn a unei probe neintroduse în reacţie, obţinută în urma unor cicluri PCR anterioare, realizate înainte de creşterea detectabilă a fluorescenţei. ΔRn reprezintă diferenţa dintre valoarea Rn+ şi cea Rn- şi indică magnitudinea semnalului generat de către PCR. O reacţie pozitivă a fost determinată în mod automat prin sistemul de detecţie, corespunzând oricărei reacţii care a avut ca rezultat o valoare ΔRn peste pragul stabilit în timpul ciclurilor precedente. Valoarea CT reprezintă ciclul în care a fost detectată prima oară o creştere semnificativă din punct de vedere statistic a ΔRn, asociată unei creşteri exponenţiale a produsului PCR. Pragul a fost definit ca deviaţia standard a emisiei de bază principale calculată pentru ciclurile PCR 3-15, înmulţită cu 10. Sistemul de detecţie a elaborat o curbă standard prin introducerea în grafice a valorilor CT pentru fiecare diluţie a standardului cunoscut (1,2 şi 1,2 x 108 echivalenţi de genom) şi a utilizat această curbă pentru determinarea valorii precise pentru probele de testat, din valoarea CT detectată.
Pentru analiza materialului genetic purificat prin tehnica RT-PCR, acesta a fost extras cu reactiv de preparare a probelor, în concordanţă cu instrucţiunile producătorului. O cantitate (1 ml) de probă preparată şi inclusă în diluant a fost supusă centrifugării la 16 000 x g pentru 10 minute în vederea sedimentării particulelor biologice, iar supernatantul a fost aspirat cu atenţie şi eliminat. Probele au fost supuse centrifugării încă o dată la 16 000 x g pentru 1 minut, toate resturile de supernatant fiind îndepărtate, iar sedimentul fiind resuspendat în 200 µl de reactiv de preparare a probei prin omogenizare puternică. Suspensiile au fost încălzite prin plutire pe baie de apă, timp de 10 minute; probele au fost îndepărtate şi lăsate la răcit la temperatura camerei pentru 2 minute, apoi centrifugate din nou la 16 000 x g pentru 2 minute. O cantitate de 50 µl de supernatant a fost adăugată peste 50 µl de diluant pentru biologie moleculară, iar proba diluată de material genetic a fost utilizată ca etalon pentru analiza RT-PCR..
Rezultate și discuții
Sindromul PDD şi implicit ABV au fost atribuite direct în cazul letalităţii pentru 34 de cazuri. Supravieţuirea a fost înregistrată în situaţia în care semnele clinice ale papagalilor s-au atenuat sau chiar au dispărut, iar aceştia au supravieţuit cel puţin o lună după prezentarea la cabinet. Screeningul prin metode standard pentru cazurile necropsiate a identificat că toate au fost păsări infectate şi au marcat pozitiv testele efectuate, şi anume: un Ara ararauna, 2 Psittacus erithacus, un Cacatua galerita, un Amazona ventralis, o Amazona aestiva, 4 Psittacula krameri.
S-a observat, de asemenea, o prezență abundentă a microorganismelor de fermentație în diverse organe ale papagalilor incluşi în studiu. Din totalul păsărilor cu patologie digestivă complexă, nouă au murit la scurt timp după sosirea la clinică, din cauza simptomelor severe. Organele disponibile ale acestor animale au fost recoltate pentru examen microbiologic şi analiză PCR. În majoritatea situaţiilor, virusul a fost depistat în cele mai multe organe ale păsărilor bolnave, inclusiv în creier, ficat, rinichi, inimă şi plămân. Probe de fecale recoltate de la toate cazurile clinice au fost pozitive doar la 24 de păsări. Omogenate din organele şi probele biologice recoltate au fost adăugate la diferite culturi de celule aviare şi mamifere. În zilele 7, 10 şi 14 post-infecţie, culturile au fost inspectate pentru evaluarea modificărilor caracteristice. Experimentele pe culturi de celule aviare şi mamifere au relevat un spectru surprinzător de larg de organe şi tipuri de celule în care virusul se dezvoltă, demonstrând că nu prezintă o preferinţă pentru celulele sistemului nervos central şi periferic.
Au fost investigate microorganismele de fermentaţie pentru toate păsările cu semne clinice tipice de PDD incluse în studiu, pentru a corela şi interpreta comparativ posibilităţile în care diagnosticul clinic evidenţiază PDD, dar rezultatele PCR sunt ABV negative, fiind posibilă evoluţia bolii ca urmare a dezvoltării unor levuri sau alte microorganisme fermentative ce pot provoca o boală similară. Rezultatele obţinute sugerează că există un factor infecţios colectiv de transmitere, iar transmiterea poate avea loc pe cale digestivă sau respiratorie.
Ca elemente concluzive
-
Bornavirusul aviar a fost confirmat ca agent etiologic primar al PDD la papagali.
-
Păsările infectate, chiar dacă nu prezintă semne clinice, constituie un rezervor de virus, asigurând eliminarea periodică de virus prin fecale.
-
Analiza probelor biologice recoltate de la păsări le poate depista pe cele bornavirus pozitive, acestea putând dezvolta semne clinice (inclusiv PDD) sau pot rămâne clinic sănătoase.
-
Perioada de incubaţie este relativ scurtă, de 12-14 zile până la 30 de zile.
-
Diagnosticarea PDD permite instituirea unei conduite terapeutice bazate în special pe antiinflamatoare (nesteroidiene), care în majoritatea cazurilor asigură stoparea de moment sau încetinirea evoluţiei bolii.
-
Prognosticul este întotdeauna nefavorabil.