Procaina și Gerovitalul H3 – noi mecanisme celulare și moleculare implicate în acţiunea lor geroprotectoare

Medicină „anti-aging” versus gerontoprofilaxie

Chiar dacă durata de viață a oamenilor (lifespan) a crescut în ultimele decenii, durata de viață sănătoasă (healthspan) nu a reușit să țină pasul cu anii noștri în același ritm. Deși suntem mai longevivi, numărul de ani pe care să îi petrecem fără bolile asociate vârstei nu a crescut proporțional. Schimbările în stilul nostru de viață, de cele mai multe ori recomandate prea târziu în cursul vieții, nu sunt suficiente pentru a preveni, a opri sau a inversa declinul și patologia asociate înaintării în vârstă. Cu toate acestea, explozia cercetărilor în domeniul îmbătrânirii și al bolilor legate de aceasta pare să aducă (cel puțin în teorie) perspective uluitoare. Se știe în prezent că atât ritmul de îmbătrânire, cât și longevitatea pot fi influențate de factorii de mediu înconjurător⁽¹⁾.

Anti-aging se referă la strategiile practice cu rol în combaterea îmbătrânirii secundare, prin intermediul unor modificări ale stilului de viață și al terapiilor care cresc speranța de viață și întârzie debutul unor maladii cronice, atribuite în mod obișnuit îmbătrânirii. Cu toate acestea, nu există nicio dovadă științifică pentru a susține ideea că aceste strategii cresc longevitatea prin modificarea proceselor de îmbătrânire. De aceea, prin anti-aging se promovează îndeosebi conceptul de „optimizare a longevității naturale”, presupunând că pentru fiecare individ există o durată maximă de viață care poate fi atinsă cu ajutorul medicinei moderne și al unui stil de viață benefic sau „favorabil”⁽²⁾.

Conceptul de compuși „geroprotectori” a fost introdus în terminologia științifică biomedicală în 1910 de către celebrul biolog Ilia Mecinikov, laureat al Premiului Nobel⁽³⁾. Deși traducerea literală a acestui termen este aceea de „protector împotriva îmbătrânirii”, în prezent se fac eforturi pentru elaborarea unui sistem de criterii care să ajute la identificarea și clasificarea acestei noi clase de medicamente. Potrivit unei recente definiții, geroprotectorii au capacitatea de a „ținti” mecanismele îmbătrânirii comune multiplelor boli asociate îmbătrânirii, cum sunt: disfuncția mitocondrială, stresul oxidativ, inflamația, hipermetilarea, lezarea ADN-ului, senescența celulară, apoptoza etc.⁽⁴⁾

Moskalev și colab. (2015) au inițiat și dezvoltat prima bază de date publică a geroprotectorilor (http://geroprotectors.org), care indexează cele mai relevante experimente ce implică o listă de peste 200 de compuși cu acțiune geroprotectoare dovedită, precum și compuși care au calitatea de potențiali „candidați” care ar putea extinde durata de viață și repara sau reduce lezările/disfuncțiile asociate îmbătrânirii, la diferite organisme studiate în modele experimentale⁽⁵⁾. Niciunul dintre compușii testați până în prezent nu are o acțiune dovedită de creştere a longevității la om.

O altă cale de explorare se bazează pe reevaluarea medicației geroprotectoare existente, cu noi metode și mijloace moderne. Este cazul rapamicinei, cunoscută ca sirolimus – medicament imunosupresor utilizat la pacienții cu transplanturi, care a fost aprobat de Food and Drug Administration (FDA) în 1999⁽⁶⁾. Metformina – cel mai prescris medicament antidiabetic din lume (lansat în 1957) – își exercită efectele geroprotectoare printr-o serie de mecanisme asemănătoare cu cele generate de restricția calorică, un model experimental cunoscut pentru extinderea duratei de viață și a sănătății la diferite organisme⁽⁷⁾.

Un alt exemplu interesant este cel al procainei – introdusă în practica medicală sub numele de novocaină, care în anii 1960-1970 a devenit primul și cel mai controversat tratament anti-aging, fiind utilizată ca ingredient activ al Gerovitalului H3 – produs original românesc elaborat între anii 1946 și 1956 de prof. dr. Ana Aslan și școala sa, după numeroase cercetări clinice și experimentale. Motivată inițial de dorința de a alina suferințele pacienților săi vârstnici, dr. Ana Aslan a deschis era prevenției și tratării îmbătrânirii⁽⁸⁾ (figura 1).

Terapia Aslan

În 1952, la București, Ana Aslan a fondat primul Institut de Geriatrie și Gerontologie din lume, iar în 1955, împreună cu academicianul Constantin Ion Parhon, a publicat studiul monografic „Novocaina – factor eutrofic și întineritor în tratamentul profilactic și curativ al bătrâneții”⁽⁹⁾ (figura 2). C.I. Parhon și Ana Aslan au fost primii care au susținut, încă din 1953, faptul că fenomenele de îmbătrânire pot fi prevenite sau, mai bine zis, întârziate. La acea dată, afirmația a surprins și a șocat. Primită de confrați cu un zâmbet ironic, această abordare este astăzi împărtășită de toți gerontologii⁽¹⁰⁾.

Istoricul descoperirii Gerovitalului H3 este de fapt parcursul procainei de la statutul de anestezic la cel de medicament creat anume să „întârzie” îmbătrânirea. Și a fost un lung parcurs al intuiției, succesului, căilor greșite, scepticismului, perseverenței și speranței. Gerovitalul poate fi considerat primul medicament „anti-aging” fabricat în lume și, în același timp, cel mai „longeviv” medicament geriatric, deoarece, de la fabricarea sa în 1957, continuă să fie utilizat atât în România, cât și în străinătate, și să suscite interes din partea comunității științifice (figurile 3 și 4)⁽⁸⁾.

Conceptul de profilaxie geriatrică „Aslan” cuprinde, alături de tratamentul cu Gerovital H3, încă nouă recomandări de „geroigienă” referitoare la stilul de viață pe care trebuie să îl adoptăm încă de la tinerețe, cu reguli pe care să le menținem pe toată durata vieții.

Decalogul gerontoprofilaxiei „Aslan” cuprinde următoarele principii care permit întreținerea sănătății și o viață activă până la o vârstă înaintată:

„Prima beneficiară a cercetărilor noastre este tinerețea, trebuie să-i învățăm pe tineri cum să prevină îmbătrânirea prematură prin măsuri profilactice care să-i ajute să-și păstreze o perioadă mai îndelungată forța de muncă, vigoarea, capacitățile creatoare. Altfel spus, trebuie să ajungem la vârsta înaintată în cele mai bune condiții – sănătatea este o stare de energie, de vitalitate, o stare de dăruire, o stare de fericire.

Tratamentul cu Gerovital H3 ca măsură profilactică, de la vârsta de 40 de ani.

Asocierea terapiei eutrofice cu o alimentație rațională, cu gimnastică și cu forme de sport la orice vârstă.

Fără noxele pe care ni le oferim singuri: alcoolul, tutunul, medicamentele etc. Pentru a nu pătrunde, fără să ne dăm seama, pe terenul abuzurilor.

Excesul ponderal favorizează ateroscleroza și diabetul, grăbește îmbătrânirea și, în final, moartea.

Măsuri profilactice adoptate pe trei niveluri, prin controale periodice: a) o profilaxie primară, prin prevenirea apariției bolilor; b) o profilaxie secundară, prin depistarea în fază inițială a bolilor cronice la care persoanele vârstnice sunt frecvent expuse și c) o profilaxie terțiară, cu scopul de a evita agravarea și complicațiile bolilor, prin aplicarea tratamentelor specifice combinate cu terapia eutrofică.

A munci este propriu omului și, în același timp, cel mai bun mijloc de a păstra tinerețea spiritului și a corpului, mai ales dacă ne facem munca cu plăcere, chiar cu pasiune.

Un stil de viață ordonat, cu activități care să alterneze cu perioade de recreere activă: sport, exerciții fizice, plimbări în aer liber etc.

O viață spirituală activă; trebuie să înțeleagă că fericirea de a fi și de a trăi este o stare pozitivă.

Adevărata longevitate este întotdeauna activă – atât intelectual, cât și fizic. Un vârstnic util lui însuși, familiei sale, societății, țării sale, nu este atât de diferit de ceilalți oameni.”⁽¹¹⁾

„Întinerirea biologică a ființei umane nu este un mit faustian, ci o problemă științifică. Există un moment optim al fiecărei vârste care întrunește toate avantajele proprii unei anumite etape a vieții. Dar acest moment optim trebuie corelat cu un scop. Viața trebuie să aibă un sens, o finalitate pe care omul își propune să o atingă și pe care cel mai adesea reușește să o atingă. O face prin activitățile sale. Mai este și problema duratei vieții. Ea este, înaintea oricărui tratament, o problemă de ereditate.”⁽¹¹⁾  

„Visez la o omenire sănătoasă și activă. Mă gândesc și la cei care vor veni după mine să conducă această acțiune. Aș dori să le las moștenire această pasiune care m-a însuflețit de-a lungul vieții. De asemenea, aș dori să păstreze amintirea exemplului meu, a strădaniilor mele pentru a ușura suferințele bătrânilor și a le dărui puțină speranță.”⁽¹¹⁾

Pe cutia de Gerovital H3 scrie că este fabricat în România, deci Gerovitalul a rămas ceea ce se cheamă un „brand de țară”, și asta pentru că prof. dr. Ana Aslan l-a promovat întotdeauna împreună cu imaginea României. Deci „conviețuim” cu Gerovitalul de aproape 70 de ani, este medicamentul mai multor generații… un produs farmaceutic accesibil, dar în același timp prețios și unic… un „elixir vintage”!⁽⁸⁾

Procaină versus Gerovital H3

Gerovitalul H3 (GH3) în formă injectabilă are ca ingredient activ clorhidratul de procaină, alături de excipienți și stabilizatori, și trebuie remarcat faptul că formula (compoziția) sa originală a rămas neschimbată până azi. Gerovitalul a fost și este utilizat în Institutul Național de Gerontologie și Geriatrie și pe întreg mapamondul, ceea ce demonstrează faptul că este un medicament a cărui eficacitate și siguranță au fost testate prin experiență clinică îndelungată⁽⁸⁾.

Procaina, moleculă sintetizată de chimistul german Alfred Einhorn în 1905, reprezintă prototipul anestezicelor locale. Este important de reținut că procaina nu generează dependență și este anestezicul cel mai puțin toxic, fiind cel mai bine tolerat medicament de pacienții vârstnici cu polipatologie, ea având efecte secundare minime și de scurtă durată. Procaina s-a dovedit însă a fi mai mult decât un anestezic și în anii 1950 diferitele școli de cercetare medicală din Europa au remarcat o diversitate surprinzătoare de efecte terapeutice nonanestezice, așa-numitele efecte pleiotrope⁽⁸⁾. Școala românească de fiziologie, prin prof. dr. Daniel Danielopolu, a remarcat multiplicitatea de acțiune a acestei substanțe, prin faptul că „exercită o acțiune uniformă asupra organismului, restabilește și crește procesele vitale active și rezistența locală”⁽¹²⁾.

În 1956, prof. dr. Ana Aslan și farm. Elena Polovrăgeanu elaborează Gerovitalul H3, cu următoarea compoziție: soluție clorhidrat de procaină 2%, acid benzoic 0,12%, metabisulfit de potasiu 0,10%, fosfat disodic 0,01%, pH 3-4. Pentru a-i asigura soluției de procaină o mai bună stabilitate, farm. Elena Polovrăgeanu i-a scăzut pH-ul la 3,3 (față de pH 4,5), fapt care permite menținerea în organism a unei cantități mai mari de procaină înainte ca aceasta să fie hidrolizată în acid para-aminobenzoic (APAB) și dietil-aminoetanol (DEAE).

În 1957 are loc omologarea Gerovitalului H3 de către Ministerul Sănătății, în urma evaluării clinice la 7600 de pacienți. Din 1957 începe producerea de către industria farmaceutică românească a Gerovitalului H3 fiole. Metoda originală de tratament – metoda „Aslan” – se aplică și astăzi în Institutul Național de Gerontologie și Geriatrie „Ana Aslan” din București („În acel moment în 1951 când a început experiența, 3 tratamente s-au efectuat cu aceeași tehnică: 3 injecții pe săptămână intramusculare, 12 injecții în 4 săptămâni, 2 săptămâni pauză și tratamentul reîncepea. Aceleași condiții de igienă, alimentație, mediu, un grup control, tratament numai simptomatic pentru afecțiunea de bază.” – figura 5).

Procaina și Gerovitalul H3 – mecanisme de acțiune

La nivel molecular și celular, situsurile de acțiune ale procainei și produșilor săi de metabolism sunt multiple, iar acțiunea sa farmacologică și farmacodinamică depinde, până la urmă, de dozaj și administrare, fapt ce susține numărul mare de efecte terapeutice.

Procaina se leagă de constituenții membranari și interacționează cu o serie de canale ionice sau influențează căi metabolice care implică mesageri intracelulari. Procaina și GH3 inhibă transportul activ atât prin reducerea activității ATP-azei Na,K-dependente, cât și prin reducerea efluxului de K⁺ din celulă (figura 6)^(13,14).

Modulând direct sau indirect conductanțele de calciu în structurile biologice excitabile sau efectoare, procaina intervine în procese-cheie fiziologice, cum ar fi menținerea homeostaziei calcice intracelulare. Este recunoscut rolul esențial al dishomeostaziei calcice intracelulare în apariția fenomenelor de declin legate de vârstă, ca și rolul ei ca factor etiopatogenic în multe boli asociate îmbătrânirii. Capacitatea GH3 și a procainei de a preveni dishomeostazia, sau de a restaura homeostazia calciului, furnizează noi argumente în favoarea efectelor terapeutice recunoscute ale acestui produs. Păstrarea permeabilității fiziologice membranare sub acțiunea procainei și a produșilor săi de hidroliză contribuie la acțiunea neurodinamică, nootropă a GH3⁽¹⁵⁾.

Acțiunea antiaritmică și antihistaminică a procainei se datorează, de asemenea, mecanismelor specifice la nivel de membrană. Procaina face parte din clasa I de medicamente antiaritmice, caracterizate prin capacitatea de a opri intrarea sodiului în timpul depolarizării membranei cardiace⁽¹⁶⁾.

Procaina poate fi considerată o moleculă sintetică cu rol biotrofic, deoarece la nivel sistemic și celular generează prin hidroliză anumiți metaboliți primari și secundari, care sunt precursori în biosinteza unor molecule esențiale pentru metabolismul celular. Date de farmacocinetică, împreună cu o serie de date din literatură, au permis schițarea căilor metabolice implicate în hidroliza in vivo a procainei. Sub acțiunea unei pseudocolinesteraze (în sânge) sau a unei carboxilesteraze microzomiale (în diferite organe și țesuturi), procaina este supusă unei hidrolize în etape: într-o primă etapă rezultă dietilaminoetanolul (DEAE) și acidul para-aminobenzoic (APAB) (metaboliți primari), pentru ca a doua etapă să conducă la eliberarea etanolaminei din DEAE. Etanolamina este precursor în biosinteza fosfolipidelor membranare: fosfatidiletanolamina (cefalina) și fosfatidilcolina (lecitina). Acest al doilea pas de metabolizare este remarcabil din punct de vedere farmacodinamic. Când, în condiții normale sau patologice, necesarul celular de etanolamină este crescut, celula apelează la constituenții fosfolipidici membranari, îndeosebi la fosfatidilserină, pe care o sacrifică. În aceste condiții, Gerovitalul H3, prin furnizarea de etanolamină exogenă, protejează integritatea membranei. O ipoteză atractivă, pentru care sunt însă necesare mai multe studii și dovezi științifice, este aceea că etanolamina suferă o conversie progresivă la acetilcolină, neurotransmițător cu rol important în funcțiile cognitive. La rândul său, APAB rezultat din scindarea procainei intră în structura acidului folic și a acidului tetrahidrofolic (indicativul H3 subliniază acțiunea de tip vitaminic a procainei)⁽¹⁷⁾.

Gerovitalul H3 a trecut cu succes proba timpului și revine în atenția cercetătorilor datorită faptului că ingredientul său activ – procaina – este recent reconsiderată pentru acțiunile sale geroprotectoare, prin care modulează procesele biochimice, celulare și moleculare implicate în senescență: stresul oxidativ, inflamația, aterogeneza, neurodegenerarea, lezarea și metilarea ADN-ului.

Într-o monografie apărută recent, au fost analizate și sistematizate informațiile relevante existente în literatura internațională (bazele de date Web of Science și PubMed) în care sunt descrise – în studii experimentale și clinice – efectele procainei și ale GH3 în prevenția și tratamentul patologiei asociate îmbătrânirii, precum și mecanismele implicate în acțiunea lor geroprotectoare la nivel celular și molecular⁽⁸⁾.

Din studiile clinice și experimentale se desprind numeroase efecte și acțiuni geroprotectoare ale procainei și Gerovitalului H3, care se manifestă asupra duratei de viață sau la nivel celular și molecular.

Prelungirea duratei de viață. Ana Aslan a inițiat și condus cel mai îndelungat studiu longitudinal la subiecți umani realizat în domeniul geriatriei (27 de ani), relevând efectul tratamentului cu GH3, de îmbunătățire a parametrilor clinici, împreună cu parametrii metabolici și funcționali, evaluați prin investigații paraclinice⁽¹⁶⁾.

Ana Aslan și colab. (1965) au inițiat și un studiu experimental, pe 1840 de șobolani albi tratați cu GH3 de la vârsta de 3 luni, iar rezultatele au indicat prelungirea duratei de viață cu 21% la animalele tratate⁽¹⁸⁾. Un alt studiu, privind influența tratamentului cu GH3 asupra duratei de viață a animalelor, s-a realizat pe un lot de 3680 de șobolani provenind de la cinci generații succesive. Rezultatele au demonstrat că GH3 a mărit durata de viață a animalelor tratate și a urmașilor netratați din prima generație a acestora⁽¹⁹⁾. În cercetările făcute pe Drosophila melanogaster s-a constatat prelungirea duratei de viață cu 22,7% la organismele cultivate pe mediu cu un conținut îmbogățit cu GH3, în comparație cu martorii⁽²⁰⁾.

Acțiunea antioxidantă a procainei și Gerovitalului H3 este parte a efectului său geroprotector. Procaina își reafirmă aceste caracteristici într-o serie de modele experimentale de ischemie-reperfuzie miocardică, inflamație, sepsis, intoxicații și iradiere cu radiații ionizante.

În general, speciile reactive de oxigen sunt generate în mod normal în cantități bazale, dar în cazul ischemiei cerebrale sau a reîncărcării cu oxigen din timpul reperfuziei sunt generate molecule care prezintă o reactivitate ridicată, care nu pot fi eliminate de sistemele antioxidante normale, provocând astfel leziuni de reperfuzie tisulară în cazul organismelor supuse experimentelor sau al pacienților⁽²¹⁾.

Anestezicele administrate prin inhalare sau cele cu administrare locală pot preveni lezarea specifică ischemiei-reperfuziei la nivel cerebral. Efectele produse de lidocaină și procaină asupra relaxării endoteliale și examinarea proprietăților antioxidante în ceea ce privește lezarea endotelială sau suprimarea generării speciilor reactive de oxigen au reprezentat un subiect fascinant. S-a dovedit că administrarea celor două anestezice în aorta abdominală de iepure protejează endoteliul vascular, în funcție de doză, prin îndepărtarea speciilor reactive de oxigen. Astfel, lidocaina și procaina au arătat o eficacitate similară în exercitarea unei acțiuni de relaxare dependentă de endoteliu, în aorta abdominală, după expunerea la speciile reactive de oxigen⁽²²⁾.

Jinnouchi și colab. (2005) au studiat dacă anestezicele locale inhibă activarea neutrofilelor indusă experimental de lipopolizaharidul component al bacteriei Gram-negative (toxina lipopolizaharidică; LPS). Autorii au constatat că 4 mM de procaină, 3 mM de lidocaină, 0.5 mM b deupivacaină sau 0.1 mM de tetracaină au inhibat cu 50% producerea de radical superoxid, ca răspuns la activarea de către peptidul chemotactic N-formil-metionil-leucil-fenilalanină (fMLP).Proprietățile antiinflamatoare ale diferitelor anestezice locale (prin reducerea TNF-α) au fost evidențiate recent în probe de sânge uman stimulate cu LPS⁽²³⁾.

Librowski și colab. (2010) au examinat comparativ efectul antioxidant al câtorva anestezice locale. Potențialul de captare (scavenger) a radicalilor (%), evaluat cu ajutorul compusului 2,2’-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-acid sulfonic) diamonium (ABTS), a scăzut în următoarea ordine: tetracaină > procaină > lignocaină > benzocaină (99%, 38%, 21% și 20%, respectiv, la concentrația de 10 mM)⁽²⁴⁾.

Takaishi și colab. (2013) au evaluat efectele anestezicelor locale procaină și lidocaină asupra producerii de oxid nitric (NO) în cultura de celule endoteliale aortice bovine, în condiții proinflamatorii. În celulele stimulate cu acetilcolină (Ach) și bradikinină, procaina în concentrație de 10 mM a inhibat producerea NO cu 35%, în timp ce în cazul celulelor incubate cu interleukina-1 beta (IL-1β) și LPS, procaina 10 mM a inhibat cu 15% producerea de NO. Autorii au sugerat că efectele inhibitorii ale procainei asupra producerii de oxid nitric sunt parțial datorate supresiei recaptării de L-arginină⁽²⁵⁾.

Substanțe precum procaina sau procainamida sunt utilizate și în aritmiile cardiace. Scopul unui studiu realizat recent de Qiang și colab. (2019) a fost de a determina efectul protector al unor derivați de 1,3,5-procain-triazină împotriva leziunii ischemiei sau reperfuziei miocardice. Acești compuși au fost testați pentru activitatea inhibitoare a factorului nuclear kB (NF-kB) indus de expunerea celulelor liniei de monocite/macrofage RAW264 la toxina lipopolizaharidică (LPS). Acțiunea antioxidantă a acestor compuși a fost investigată prin teste specifice – generarea radicalului hidroxil, anionului superoxid și a peroxidării lipidice – cu sonde redox – DPPH, precum și enzimele antioxidante: superoxid dismutaza, catalaza, glutation și glutation peroxidaza⁽²⁶⁾.

Acești compuși au fost evaluați ulterior și pentru efectul protector împotriva leziunii miocardice a ischemiei sau a reperfuziei (I/R) pe baza a numeroși parametri hemodinamici (presiunea dezvoltată în ventriculul stâng, dp/‌dt max, fluxul coronarian și ritmul cardiac), a enzimelor miocardice (creatinkinază și lactat-dehidrogenază), a receptorului de lipoproteină oxidată de densitate joasă lectin-like (LOX-1) și NF-kB. Astfel, compușii derivați de 1,3,5-procain-triazină au arătat o inhibare semnificativă a activității transcripționale a NF-kB în celulele RAW264 stimulate cu LPS. Rezultatele in vitro au arătat o reducere eficientă a generării radicalului hidroxil, reducerea DPPH-ului și neutralizarea anionului superoxid în urma tratamentului cu acești derivați de procaină, sugerând o acțiune cardioprotectoare semnificativă⁽²⁶⁾.

Și alte cercetări experimentale, mai puțin recente, au demonstrat că procaina și GH3 inhibă generarea speciilor reactive ale oxigenului și peroxidarea lipidică în sisteme enzimatice și neenzimatice, corelat cu efectul modulator asupra activității superoxid dismutazei (SOD) în creier și a catalazei în ficatul și rinichiul de șobolan^(27,28).

Un studiu recent realizat de Ungurianu și colab. (2020), în care au fost utilizate o serie de modele experimentale specifice pentru evaluarea lezării ADN-ului, a dovedit acțiunea radioprotectoare a Gerovitalului H3 și a procainei. Experimentele s-au realizat pe celule mononucleare izolate din sânge periferic (peripheral blood mononuclear cells; PBMCs) izolate de la subiecți tineri și vârstnici, care au fost tratate in vitro cu diferite concentrații de procaină și Gerovital H3, ele fiind apoi expuse radiației ionizante. Datorită unei stabilități mai mari a procainei condiționate ca GH3, proprietățile antioxidante și biotrofice ale procainei au putut fi menținute un timp mai îndelungat, ceea ce explică efectul radioprotector al GH3 prin împiedicarea lezării ADN-ului atât în celulele izolate de la subiecții tineri, cât și în cele de la vârstnici. Gerovitalul H3 a exercitat un efect protector semnificativ asupra ADN-ului în celulele izolate de la subiecți tineri. Procaina a redus cantitatea de ADN lezată endogen în celulele „bătrâne”. La concentrații mari, procaina și Gerovitalul H3 au avut un efect genotoxic. Însă cel mai interesant aspect este efectul protector în cazul celulelor izolate de la subiecții vârstnici: în urma incubării cu Gerovital H3, ADN-ul celulelor „bătrâne” contracarează acțiunea radiației la fel ca ADN-ul celulelor „tinere” netratate (figura 7)⁽²⁹⁾.

Acțiunea antiaterogenă. GH3 și procaina își exercită efectul asupra procesului de aterogeneză prin mai multe mecanisme independente, constând fie în diminuarea nivelului lipidelor și lipoproteinelor plasmatice, fie prin mecanisme antioxidante, diminuând stresul oxidativ exercitat asupra structurilor de membrană, precum și asupra lipoproteinelor serice^(30,31). Acțiunea antiaterogenă a procainei a fost analizată în diferite modele experimentale de disfuncție endotelială indusă de radicali liberi și în modularea metabolismului lipidic – biosinteza colesterolului și a esterilor săi la nivel plasmatic și tisular, cu impact la nivel endotelial și cu potențiale aplicații clinice în tratamentul hipercolesterolemiei^(32,33,34). Recent a fost investigat efectul procainei și al GH3 asupra oxidării LDL mediate celular, prin incubarea LDL nativ, izolat din plasmă umană, în prezența condițiilor prooxidante și a macrofagelor diferențiate dintr-o linie de monocite umane – U973. Produșii finali ai peroxidării lipidice, cum sunt malondialdehida (MDA) și 4-hidroxinonenal (HNE), generați de acțiunea macrofagelor și a Fe²⁺ asupra LDL, au fost evaluați din mediul de cultură prin reacția cu acidul tiobarbituric (TBARS). Atât procaina, cât și GH3 au inhibat semnificativ formarea de TBARS la toate concentrațiile testate, dar efectul inhibitor al GH3 a fost mai mare decât cel al procainei la cea mai mare concentrație (2 mM) testată⁽²⁹⁾.

Acțiunea antineoplazică prin mecanisme epigenetice a procainei este descrisă în cele mai numeroase și recente studii din fluxul științific internațional. Este cunoscut faptul că procesul de îmbătrânire determină hipermetilarea unor gene, inclusiv a genelor care ne apără de cancer. Și de aici interesul utilizării procainei, recent considerată substanță de referință în rândul agenților de demetilare și cu efecte de supresie tumorală⁽³⁵⁾. Spre deosebire de modificările genetice, modificările în metilarea ADN-ului sunt potențial reversibile în prezența unor agenți terapeutici. Procaina, fiind cunoscută ca unul dintre agenții chimioterapeutici convenționali, a demonstrat un mod de acțiune de tip epigenetic – ca agent demetilant pentru fragmentele citozină-fosfat-guanină (CpG) din molecula de ADN hipermetilată – și a devenit una dintre opțiunile principale în tratarea diferitelor tipuri de cancer⁽³⁶⁾.

În acest sens, procaina ar putea fi inclusă în categoria inhibitorilor non-nucleozidici ai ADN-metiltransferazelor. Procaina inhibă ADN-metiltransferazele, atât în celulele normale, cât și în cele canceroase, prin interacțiunea directă cu ADN-ul sau cu diferitele căi de semnalizare celulară implicate în dezvoltarea tumorală. Acest lucru a fost demonstrat încă din 2003, pe diferite modele experimentale de cancer – culturi de celule tumorale și animale cu xenografturi⁽³⁶⁾.Acțiunea antitumorală a procainei se mai manifestă și prin inhibiția proliferării și migrării celulare și creșterea apoptozei celulelor tumorale.

În experimente care au utilizat linia de celule MCF-7, obținută din tumori canceroase de sân, s-a descoperit că procaina este un agent demetilant care reduce cu 40% 5-metil-citozina din ADN, evaluată prin electroforeză capilară de înaltă performanță. Procaina poate, de asemenea, să demetileze așa-numitele „insule CpG hipermetilate”, cum ar fi cele situate în regiunea promotoare a genei RARβ (retinoic acid receptor beta – asociat cu inițierea/progresul cancerului), cu restabilirea expresiei pentru genele a căror exprimare este redusă sau chiar suprimată (silenced). De asemenea, procaina inhibă creșterea celulelor canceroase și se comportă asemănător procainamidei, care restabilește expresia unor gene hipermetilate din celulele canceroase de prostată și diminuează creșterea tumorii xenograft (tumoră umană transplantată la șoareci). Este important de menționat faptul că dozele de procaină care obțin efecte demetilante semnificative și efecte de inhibare a creșterii sunt similare cu cele administrate împreună cu medicamente antineoplazice sau cu radioterapia. Cel mai important aspect dovedit în urma experimentelor este acțiunea protectoare a procainei împotriva toxicităților nefrotice și hepatice legate de chimioterapie. Având o utilizare îndelungată și sigură ca anestezic local, cu bine cunoscute caracteristici farmacologice, se poate trece la faza de studii preclinice și clinice pentru validarea sa în terapia epigenetică a cancerului⁽³⁷⁾.

Utilizarea procainei ca agent de demetilare își găsește aplicații nu doar în terapia anticanceroasă, ci și în tehnicile de clonare prin metoda transferului nuclear de celule somatice (somatic cell nuclear transfer; SCNT). Această tehnologie are multe aplicații potențiale, cum ar fi în producerea de animale transgenice sau modificate genetic. Un studiu recent a utilizat procaina și S-adenosil-L-homocisteina (SAH) ca agenți demetilatori într-o cultură de celule fibroblaste izolate din piele bovină⁽³⁸⁾.

În cursul experimentului au fost observate efectele procainei și SAH asupra expresiei genelor specifice „mașinăriei” epigenetice, incluzând ADN-metiltransferaza 1 (DNMT1), ADN-metiltransferaza 3 alfa (DNMT3A), ADN-metiltransferaza 3 beta (DNMT3B), precum și nivelul de metilare al ADN-ului din fibroblastele de piele bovină. Rezultatele arată că nivelurile de metilare ale ADN-ului au fost reduse de SAH și de combinația de SAH + procaină, comparativ cu cea din grupul de control. În ceea ce privește expresia genelor, a existat o scădere a nivelului de transcriere a DNMT1 în celulele cultivate cu SAH și SAH + procaină și în final s-a constatat o scădere a nivelului de transcriere a DNMT3B în celulele cultivate cu procaină, SAH și SAH + procaină. În concluzie, utilizarea procainei și a SAH în cultura in vitro de celule de origine bovină a fost capabilă să modifice profilul epigenetic al celulelor, această abordare putând fi o strategie alternativă, foarte utilă pentru îmbunătățirea eficienței reprogramării nucleelor somatice după fuziune, ceea ce, la rândul său, va îmbunătăți eficiența transferului nuclear de celule somatice⁽³⁸⁾.

Prin urmare, cercetările în ceea ce privește descoperirea de medicamente chimioterapeutice eficiente sau combinații ale acestora sunt în continuă desfășurare. Mai multe studii și-au concentrat atenția asupra unei posibile aplicări a unei combinații de medicamente chimioterapeutice pentru tratarea cancerului de colon. În urma unui studiu recent, care a avut ca obiectiv principal identificarea rolului procainei (ca reprezentant al medicamentelor inhibitoare de ADN-metiltransferază – DNMT) combinată cu alte medicamente chimioterapeutice, precum carboplatina, erlotinibul, fenilbutiratul de sodiu și vorinostatul (ca reprezentanți ai medicamentelor inhibitoare de histon deacetilaze; HDAC), în demetilarea întregului genom al celulelor canceroase de colon de tip HCT116 (o linie de celule canceroase de colon uman, utilizate în cercetarea terapeutică și în screeningul de medicamente), s-au făcut numeroase observații importante⁽³⁹⁾.

Astfel, linia de celule HCT116 a fost tratată cu două concentrații (3 µM și 5 µM) de procaină sau combinații cu alte medicamente, iar cuantificarea globală a metilării ADN-ului a fost utilizată pentru a identifica rolul acestor medicamente individual sau în combinație în hipo- sau hipermetilarea dinucleotidei CpG pe întregul genom al liniei celulare HCT116 de cancer de colon. Rezultatele au arătat că utilizarea procainei combinate cu carboplatin în doză mică (3 µM) a fost cel mai eficient tratament capabil să reducă nivelul de metilare globală. Pe de altă parte, datele au indicat că aplicarea unor doze mai mari de medicamente în cursul studiului a determinat promovarea proliferării celulare. Totodată, s-a observat că utilizarea dozelor mici de medicamente a fost mai eficientă în controlul proliferării celulelor canceroase. Deci ar trebui elucidat mecanismul prin care dozele mai mari de procaină au promovat proliferarea celulelor canceroase de tip HCT116⁽³⁹⁾. 

Și în cancerul gastric, măsurarea globală a metilării ADN-ului a demonstrat că procaina reduce semnificativ nivelul global de metilare al ADN-ului. Analiza expresiei și activității ADN-metiltransferazelor (DNMTs) a arătat că procaina a reprimat activitatea, dar nu și expresia izoformelor DNMT1/DNMT3A. Mai mult decât atât, analizele RT-qPCR elucidează faptul că procaina conduce la reglarea genelor CDKN2A și RARβ, datorită activării promotorului ce acționează asupra acestora⁽⁴⁰⁾.

Un număr mare de studii preclinice a arătat că anestezicele locale au efect inhibitor direct asupra activității tumorale incluzând supraviețuirea, proliferarea, migrarea celulelor tumorale și activitatea invazivă a acestora^(41,42,43).

Recent, Moreira-Silva și colab. (2020) au citat procaina printre medicamentele „repropuse” (repurposed drugs) care au demonstrat rezultate promițătoare ca inhibitori epigenetici in vitro⁽³⁵⁾.

Cancerul pulmonar este caracterizat de creșterea celulelor maligne sau benigne, la nivelul unuia sau ambilor plămâni, al bronhiilor sau alveolelor pulmonare. Deși procaina a fost raportată ca fiind utilă în diferite tipuri de tumori, inclusiv în cancerul de ficat și cancerul de sân, efectul acestei substanțe asupra cancerului pulmonar a fost abia recent investigat⁽⁴⁴⁾.

Gao și colab. (2009) au oferit prima dovadă a faptului că procaina este capabilă de a reactiva în celule de cancer pulmonar factorul-1 inhibitor Writ (WIF-1) „tăcut” în urma hipermetilării promotorului. Deci, in vitro, procaina și procainamida pot inhiba calea de semnalizare a Wnt canonică prin demetilarea promotorului WIF-1 în celulele canceroase pulmonare de tip H460 și A549. A fost testată în principal eficacitatea antitumorală in vivo a procainei utilizându-se modelul murin de celule canceroase NSCLC10 (non-small-cell lung carcinoma). S-a observat faptul că, la șoarecii nud inoculați cu celule A549 sau NCIH1975, tratamentul cu procaină (50 mg/kg/zi) a atenuat creșterea tumorală semnificativ, în timp ce o doză mai mare administrată nu a exercitat nicio modificare, rezultat în acord cu datele obținute in vitro în care doza mică de procaină (100 nM) inhibă proliferarea celulară a celor două tipuri de celule canceroase pulmonare. Mai mult, s-a constatat că procaina ar putea inhiba expresia PCNA tumorală (un marker al proliferării celulare)⁽⁴⁵⁾.

Cancerul osos, care poartă denumirea de osteosarcom, apare și se dezvoltă din celulele osoase imature care formează în mod normal țesutul osos nou, în general dezvoltându-se la nivelul piciorului, la femur sau tibie, în jurul articulației genunchiului și nu numai. Studiile recente au observat că efectul inhibitor al procainei se realizează prin reglarea microARN-ului (miARN), MiR-133b dovedindu-se a fi un supresor tumoral în osteosacrom. În cursul acestui studiu, celulele MG63 au fost tratate cu concentrații diferite de procaină, iar viabilitatea celulară, apoptoza și expresia miR-133b au fost apoi detectate prin metode specifice: MTT, citometrie în flux și, respectiv, qRT-PCR, celulele fiind apoi transfectate cu ajutorul inhibitorului miR-133b și tratate cu 2 µM de procaină. Rezultatele obținute au arătat că procaina a inhibat semnificativ viabilitatea celulară, a promovat apoptoza și nivelul de exprimare al miR-133b într-o manieră dependentă de doză. Mai mult decât atât, în cursul cercetărilor s-a observat că inhibitorul procainei și al miR-133B a inversat dramatic efectele procainei asupra viabilității celulare, apoptozei și migrației. În plus, procaina a scăzut semnificativ nivelul de p/t-AKT, p/t-ERK și p/t-S6, în timp ce inhibitorul procainei și al miR-133b a declanșat aceste efecte⁽⁴⁶⁾.

Un studiu recent demonstrează că procaina este agent antimetastazic într-un model experimental de hepatocarcinom celular, prin faptul că inhibă tranziția celulelor canceroase de la fenotipul epitelial la cel mezenchimal, prin activarea markerilor specifici celor două tipuri de celule. Ca mecanism, procaina inhibă receptorul c-Met (cu funcție tirozinkinazică) și de aici și căile de semnalizare specifice oncogenezei și, prin urmare, inhibă HGF (factorul de creștere hepatică)⁽⁴⁷⁾. Un alt mecanism care evidențiază acțiunea anticanceroasă a procainei este interacțiunea sa directă cu molecula de ADN. Într-un studiu de spectroscopie și modelare moleculară, Ali și colab. (2018) au utilizat docking-ul molecular asupra cinci structuri diferite ale B-ADN (extrase din Protein Data Bank) și au arătat că procaina se fixează de regiunile bogate în adenină-timină (AT) ale celor cinci structuri B-ADN din timusul de vițel. Tot ei au descoperit și faptul că procaina singură sau în combinație cu doxorubicina acționează ca donor de electroni pentru bazele ADN⁽⁴⁸⁾.

Acțiunea neuroprotectoare a procainei excedă acțiunile sale anestezice la nivelul sistemului nervos central (SNC). Au fost demonstrate, în diferite studii preclinice și clinice, câteva efecte benefice ale procainei și GH3, precum ameliorarea depresiei și a abilităților cognitive (comportament condiționat, memorie) și rezistență cerebrală crescută la diverse acțiuni agresoare (intoxicație acută, hipoxie, șoc electric)^{(49,50,51,52,53)}.

Monoaminoxidazele (MAO), o clasă de enzime implicată în metabolismul catecolaminelor și al altor amine biogene, sunt din ce în ce mai mult recunoscute drept contributori importanți la generarea de specii reactive de oxigen. Cel mai bine cunoscute și caracterizate izoforme MAO sunt cea endotelială și cea neuronală. Totuși, izoformele inductibile, care pot fi exprimate în diverse țesuturi și organe, au dobândit notorietate și au stimulat interesul pentru studierea rolurilor extracerebrale ale acestor enzime⁽⁵⁴⁾. La om, expresia MAO și capacitatea lor de a produce specii reactive de oxigen crește cu vârsta: de patru ori în cazul MAO-B din țesutul neuronal și de șase ori în cazul MAO-A din țesutul cardiac. Aceste enzime sunt implicate în etiologia patologiilor cronice asociate vârstei: tulburări depresive, parkinsonism, boli cardiace și diabet^(55,56). Acțiunea inhibitorie a procainei asupra MAO-B a fost demonstrată în urma unor studii de farmacodinamică, iar GH3 a fost inclus în categoria inhibitorilor MAO reversibili și competitivi^{(57,58,59,60)}.Inhibiția activității MAO de către anestezice locale depinde atât de interacțiunile electrostatice, cât și de cele hidrofobe, dintre aceste medicamente și fosfolipidele asociate enzimei sau regiunilor proteice⁽⁶¹⁾. Efectul inhibitor MAO a fost asociat cu inhibiția peroxidarii lipidice în omogenatele de creier de șobolan și în fracțiunea mitocondrială, sugerând faptul că activitatea MAO poate fi inhibată printr-o limitare a reacțiilor radicalilor liberi^(62,63). Prin aceste două efecte – de antioxidant și inhibitor MAO – se justifică utilizarea în clinică a GH3 în tratamentul depresiilor (asociate cu un deficit de serotonină și noradrenalină în creier) și a maladiei Parkinson.

Utilizând celule PC12 de feocromocitom, Lecanu și colab. (2005) au observat că procaina este un ligand al receptorului sigma 1, o proteină ai cărei liganzi protejează funcția mitocondrială și exercită proprietăți antidepresive. S-a arătat, de asemenea, că procaina are puternice proprietăți neuroprotectoare împotriva peptidului amiloid Aβ_1-42 și a depleției de ATP induse de acest peptid amiloid. Procaina a inhibat efectul neurotoxic al glutamatului asupra celulelor PC12, sugerând că reducerea neurotoxicității induse de glutamat ar putea fi mecanismul prin care procaina își exercită efectul ei „antiamiloid”⁽⁶⁴⁾. Li și colab. (2016) au studiat efectul tratamentului cu procaină într-un model experimental de durere neuropată la șobolan. Procaina a inhibat expresia kinazei 2 Janus (JAK2), transductorul de semnal celular și expresia activatorului de transcriere 3 (STAT3), atât la nivelul ARN-mesager, cât și al sintezei proteice, acesta fiind mecanismul la nivel celular pentru atenuarea durerii neuropate⁽⁶⁵⁾. Recent, Wu și colab. (2020) au sintetizat o serie de compuși – derivați imidazolici ai procainei – cu potențială activitate inhibitorie selectivă asupra MAO-B și efecte anti-Parkinson in vivo, utilizând modelul experimental de boală Parkinson cu MPTP (1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridină). Acești compuși pe bază de procaină au determinat o ameliorare semnificativă a funcției motorii la șoareci, prin evaluarea comportamentului motor și, de asemenea, au îmbunătățit nivelul enzimelor antioxidante la nivel cerebral, în striatum⁽⁶⁶⁾.

Vreme îndelungată, infuziile cu procaină au fost aplicate pacienților cu tulburări psihovegetative, mai ales în timpul terapiei neurale – un tratament complementar obișnuit care utilizează injecții cu anestezice locale cu acțiune de scurtă durată pentru a trata durerea și bolile cronice. Totuși, se cunosc puține despre mecanismele care stau la baza acestei terapii, precum și despre domeniul răspunsului la tratament. Hahn-Godeffroy și colab. (2019) au studiat, în cazul a 56 de pacienți, efectul procainei administrate cronic intravenos asupra stării de sănătate somatică și psihovegetativă. După patru sau șase luni de tratament, pentru 75% dintre pacienți s-a observat o ameliorare a hedoniei, a bucuriei și a somnului. În cazul a 62,5% dintre pacienți s-a observat o atenuare substanțială a reacțiilor la stres, a lipsei de energie și a anxietății. Toate aceste schimbări au fost semnificative după două, patru și șase luni, comparativ cu starea de dinaintea tratamentului, sugerând o ameliorare de lungă durată a simptomelor psihovegetative și somatice sub tratamentul cu procaină, care a modulat activitățile unor arii cerebrale specifice precum sistemul limbic⁽⁶⁷⁾.

Haller și colab. (2018) au realizat, în cazul a 22 de pacienți cu diagnostice multiple, o analiză calitativă bazată pe autopercepție, după terapia neurală cu procaină injectată. Pacienții au simțit o eliberare emoțională și ameliorarea simptomelor fizice, o dispoziție mai bună, acceptarea durerilor și o îmbunătățire a capacității fizice. Efectele adverse ale terapiei neurale au inclus: durere la locul injectării, suferință vegetativă și confuzie emoțională, care au durat câteva minute, ore sau cel mult două zile⁽⁶⁸⁾.

Oettmeier și colab. (2019) au raportat utilizarea clinică a infuziei cu doze mari de clorhidrat de procaină cu bicarbonat de sodiu ca aditiv pentru tratamentul diferitelor boli acute, durerii cronice și inflamației⁽⁶⁹⁾. Xu și colab. (2016) au investigat efectele utilizării zilnice a Gerovitalului H3 tablete timp de trei luni asupra ameliorării simptomelor mentale și a îmbunătățirii calității vieții dependente de sănătate, în cazul vârstnicilor din China. Studiul a fost randomizat, dublu-orb cu control placebo și a inclus 100 de participanți eligibili, bărbați și femei, cu vârste între 50 și 89 de ani. Tratamentul cu GH3 a arătat rezultate pozitive, susținând sănătatea mintală și ameliorarea sănătății în general și a stării de bine, în timp ce funcția cognitivă a vârstnicilor a fost recuperată. Nivelurile medii ale stărilor de dispoziție scăzută și anxietate (evaluate cu Self-Rating Depression and Anxiety Scales) au fost ambele reduse, iar prevalența ratei anxietății clinice a fost scăzută⁽⁷⁰⁾.

Procaina – geroprotectorul „demodat” versus „candidat”

De la descoperirea sa în 1905 și utilizarea în practica medicală ca anestezic local și apoi ca medicament „anti-aging” în anii 1960-1970, procaina este parte a istoriei medicinei și a gerontoprofilaxiei. După 70 de ani de la publicarea monografiei „Novocaina – factor eutrofic și întineritor în tratamentul profilactic și curativ al bătrâneții”, aceste noi dovezi privind acțiunea geroprotectoare a procainei și a Gerovitalului H3 la nivel celular și molecular confirmă intuiția, supozițiile, observațiile și studiile acad. prof. dr. Ana Aslan cu privire la acțiunea „întineritoare” a Gerovitalului H3 și pot constitui o bază pentru noi cercetări.

Procaina poate fi considerată un medicament „veteran” datorită utilizării sale îndelungate în practica clinică, dar ea este și o moleculă care continuă să incite interesul cercetătorilor, relevând noi efecte biologice și farmacologice în urma demersurilor experimentale inovatoare. Din cele mai noi cercetări raportate la nivel internațional a rezultat un profil farmacologic complex al procainei – o moleculă care exprimă o diversitate de efecte biologice, funcționând ca antioxidant, antiinflamator, cardioprotector, neuroprotector, radioprotector, citoprotector și agent de demetilare⁽⁷¹⁾. Noile dovezi științifice aduse în sprijinul efectelor benefice ale procainei și Gerovitalului H3 susțin, în continuare, utilizarea lor pe scară largă pentru prevenția îmbătrânirii precoce, ameliorarea patologiei de vârstă și obținerea unei longevități active.

Abordările viitoare ale cercetării procainei se vor concentra cu siguranță pe evaluarea efectelor sale și a mecanismelor de acțiune asupra duratei de viață și reglării ciclului celular, autofagiei și activității proteazomului, senescenței replicative – lungimea telomerilor și activitatea telomerazei, incluzând căile de semnalizare celulară asociate procesului de senescență. Numai așa vom putea înțelege deplin acțiunea de modulare a mecanismelor procesului de îmbătrânire de către procaină și vom putea realiza o utilizare judicioasă a medicamentelor pe bază de procaină în tratamentul diverselor tulburări metabolice și degenerative, întâlnite în mod obișnuit la pacienții vârstnici, dar care în prezent par să afecteze oameni din ce în ce mai tineri.   

Autor corespondent:  Prof. dr. Daniela Grădinaru E-mail: daniela.gradinaru@umfcd.ro

CONFLICT OF INTEREST: none declared.

FINANCIAL SUPPORT: none declared.

This work is permanently accessible online free of charge and published under the CC-BY.