Implicaţiile terapeutice ale stresului oxidativ în leziunile scuamoase neoplazice cervicale

Cancerul reprezintă una dintre principalele cauze de deces la nivel mondial⁽¹⁾, cu impact economic ÅŸi social considerabil, în ciuda cercetării extensive pentru descifrarea mecanismelor sale moleculare, precum ÅŸi pentru dezvoltarea de strategii terapeutice orientate – conceptul de medicină personalizată. Cancerul de col uterin este o afecÅ£iune ce se dezvoltă progresiv, cu diferite stagii de modificări celulare, de la epiteliu normal la carcinom invaziv. Stresul oxidativ poate activa o serie de factori de transcripÅ£ie, cum ar fi NF-kB, AP-1, p53, HIF-1a, PPAR-g, b-catenina/Wnt ÅŸi Nrf2, ce poate duce la activarea a peste 500 de gene diferite, inclusiv cele pentru factori de creÅŸtere, citokine inflamatorii, chemokine, molecule reglatoare ale ciclului celular ÅŸi antiinflamatorii⁽²⁾.

Stresul oxidativ intrinsec ÅŸi de la nivelul micromediului are un rol critic în dezvoltarea ÅŸi răspândirea cancerului. Speciile reactive de oxigen (ROS) pot acÅ£iona nu doar ca susÅ£inători ai celulelor tumorale, ci pot căpăta comportament antitumoral, care ar putea fi extrem de eficace în tratamentul cancerului. Celulele canceroase prezintă modificări prooxidative⁽³⁾ generate de: 1) activarea cronică a diferitelor surse metabolice ale ROS, legate de oxidazele NADPH (NOXs 1-5 ÅŸi DUOX1/2)⁽⁴⁾, modificări ale ADN-ului mitocondrial, ale fosforilării oxidative ÅŸi ale metabolismului energetic, însoÅ£ite de creÅŸterea glicolizei aerobe⁽⁵⁾; 2) un răspuns antioxidant disfuncÅ£ional care nu este în măsură să contracareze producÅ£ia susÅ£inută de ROS în timpul genezei tumorale⁽⁶⁾. Aceste modificări oxidative intracelulare sunt completate de expunerea constantă a celulelor canceroase la ROS exogene derivate din ciclurile anoxie-reoxigenare⁽⁷⁾ ÅŸi din activitatea oxidativă a monocitelor ÅŸi neutrofilelor ce infiltrează tumorile⁽⁸⁾.

Cancerul nu reprezintă un proces de „totul sau nimic”, ci integrează diverse repere într-o reÅ£ea patologică de evenimente ÅŸi răspunsuri celulare sub influenÅ£a mai multor tipuri de stres – oxidativ ÅŸi inflamator. ROS susÅ£in tumorigeneza ÅŸi progresia tumorală, dar sunt, de asemenea, instrumente terapeutice eficiente antitumorale.
 

Prin creşterea ROS la nivel tumoral se poate contracara acţiunea ROS metabolice de promovare a creşterii celulelor canceroase.

Literatura de specialitate descrie influenÅ£a stresului oxidativ în procesele fiziologice de la nivelul sistemului reproductiv feminin, inclusiv menopauza⁽⁹⁾, dar în prezent datele din literatură sunt limitate în ceea priveÅŸte statusul redox al tumorilor genitale feminine, de aceea considerăm că o mai bună înÅ£elegere a acestui fenomen poate duce la îmbunătăţirea protocoalelor clinice curente, atât în screening, cât ÅŸi în terapie.

Heterogenitatea tumorală derivă, de asemenea, din distribuÅ£ia spaÅ£ială neuniformă a stresului la nivelul micromediului, cum ar fi hipoxia, acidoza, stresul oxidativ ÅŸi pierderea nutrienÅ£ilor⁽¹⁰⁾. Deoarece terapiile pe bază de stres oxidativ sunt dependente în special de furnizarea locală de oxigen molecular, celulele canceroase localizate în regiuni hipoxice ar putea să nu răspundă la astfel de terapii.
 

Studiul de faţă a vizat identificarea markerilor moleculari ce caracterizează stresul oxidativ, dar ÅŸi statusul antioxidant al tumorilor genitale. Prin termenul marker am înÅ£eles orice entitate biologică sau fiziologică utilizată pentru identificarea unui subtip de neoplazie, ghidarea terapiei sau monitorizarea pentru a evita recidiva.

Lotul de studiu a fost caracterizat iniÅ£ial histologic, utilizând sistemele de clasificare internaÅ£ionale ÅŸi, ulterior, s-a efectuat profilul fenotipic prin utilizarea următorilor markeri de stres oxidativ exprimaÅ£i la nivelul Å£esutului tumoral sau peritumoral, relativ la peroxidarea lipidică (malon dialdehida; MDA), oxidarea ADN (8-oxoguanine; 8-OHdG) ÅŸi nitrozilarea proteinelor (nitrotirozina; 3-NT).

Lotul studiat a inclus 32 de cazuri pozitive pentru leziuni epiteliale cervicale, cu variaÅ£ii ale vârstei de prezentare, iar spectrul leziunilor a variat de la leziuni intraepiteliale de grad scăzut până la carcinom scuamos cervical invaziv.
 

Examinarea histopatologică a secÅ£iunilor tisulare rămâne metoda cea mai utilizată în diagnosticul leziunilor preneoplazice ÅŸi neoplazice ale colului uterin. Confirmarea histopatologică a diagnosticului de invazie este necesară pentru instituirea unor metode terapeutice adecvate. Pe lângă descrierea morfologică ÅŸi încadrarea într-o clasă de leziuni, examinarea microscopică poate oferi ÅŸi în leziunile de col uterin, cum deja este cazul în alte leziuni, informaÅ£ii valoroase, având încă un potenÅ£ial incomplet exploatat.
 

În cursul metabolismului celular normal se consumă oxigen ÅŸi se produc specii reactive de oxigen (ROS). Dacă nu sunt disipate în mod eficient, ROS se pot acumula ÅŸi distrug proteinele reziduale, lipidele ÅŸi ADN-ul. Enzimele implicate în reglarea redoxului ÅŸi reparaÅ£ia ADN-ului disipă ROS ÅŸi repară daunele rezultate pentru a păstra un mediu celular funcÅ£ional⁽¹¹⁾, deoarece acumularea de ROS crescute ÅŸi/sau deteriorarea necorespunzătoare a ADN-ului pot duce la iniÅ£ierea ÅŸi progresia cancerului. Am încercat identificarea unui număr de proteine de stres oxidativ ÅŸi reparare ADN-ului care influenÅ£ează capacitatea de reacÅ£ie estrogenică a celulelor neoplazice scuamoase ÅŸi expresia lor diferită în Å£esutul normal, leziunile displazice de diferite grade (CIN) ÅŸi carcinomul invaziv. Cancerul prezintă o modificare prooxidativă în starea de reducÅ£ie oxidativă. Nicotinamida-adenin-dinucleotid-fosfat-oxidaza (NADPH oxidaza) este una dintre cele mai importante surse endogene de ROS din organism. Acest sistem enzimatic se integrează cu diferite proteine distribuite între citoplasmă ÅŸi membrană. Stresul oxidativ ÅŸi nitrozativ perpetuează procesul inflamator prin diferite mecanisme. ROS ÅŸi NRS au efecte chemotactice care favorizează recrutarea neutrofilelor⁽¹²⁾.
 

NO este un gaz uÅŸor solubil ÅŸi se poate răspândi destul de uÅŸor în mediul biologic. El poate, de asemenea, să reacÅ£ioneze cu superoxidul radical pentru a produce ONOO-, care, la rândul său, poate nitra tirozina, formând 3-nitrotirozina (3NT). ONOO^‒ determină oxidarea lipoproteinelor ÅŸi nitrarea reziduurilor proteice de tirozină. Peroxinitritul este dificil de investigat ÅŸi indirect evidenÅ£iat prin proteinele nitrate⁽¹³⁾.
 

Rezultatele obÅ£inute indică o relaÅ£ie semnificativă între stresul oxidativ ÅŸi leziunea neoplazică. CreÅŸterea procentuală a expresiei markerilor a fost direct proporÅ£ională cu gradul leziunii epiteliale. Expresia markerilor IHC este mai intensă în celulele epiteliale versus stromale. ExistenÅ£a unui gradient de expresie stromală este importantă.

Deteriorarea proteinelor (nitratarea proteinelor) a fost determinată ÅŸi analizată în secÅ£iunile histologice cu leziuni neoplazice ale colului uterin, utilizând un anticorp monoclonal împotriva 3-NT pentru a cuantifica 3-NT (imunohistochimie).

MDA (malondialdehida) este o aldehidă cu greutate moleculară joasă, apărută ca urmare a combinaÅ£iei  din­tre radicali liberi ÅŸi acizi graÅŸi polinesaturaÅ£i (PUFA) din procesul de degradare al fosfolipidelor membranare. Alterarea structurii ÅŸi funcÅ£iei membranare ar putea induce progresia leziunilor neoplazice. MDA este utilizat în evaluarea procesului de peroxidare lipidică.

Malondialdehida (MDA) este un produs endogen, rezultat ca urmare a peroxidării lipidelor ÅŸi a biosintezei prostaglandinelor ÅŸi participă la o varietate de reacÅ£ii chimice ÅŸi biologice, inclusiv legarea covalentă la proteine, ARN ÅŸi AND. MDA este utilizat pe scară largă pentru evaluarea procesului de peroxidare a lipidelor. ROS generate cauzează peroxidarea acizilor graÅŸi polinesaturaÅ£i (PUFA) ai membranei, fenomenul purtând denumirea de peroxidare lipidică⁽¹⁵⁾. Acest lucru întrerupe integritatea membranei, care poate fi unul dintre motivele posibile ale progresiei leziunilor neoplazice maligne. Nivelurile crescute ale MDA indică peroxidarea lipidică crescută, care este o consecinţă a generării de radicali liberi crescuÅ£i. Aceasta provoacă alterarea profundă a funcÅ£iei membranei celulare ÅŸi, de asemenea, organizarea structurală a ADN-ului, care conduce la mutaÅ£ii⁽¹⁵⁾. Pentru măsurarea deteriorării ADN-ului oxidant la secÅ£iunile histologice, am folosit anticorpul monoclonal împotriva MDA-ADN. Această metodă ar trebui să fie utilă pentru detectarea sensibilă a deteriorării ADN-ului într-un număr mic de celule ÅŸi secÅ£iuni de Å£esuturi.
 

MDA este cea mai abundentă aldehidă individuală ce rezultă din peroxidarea lipidelor. Deteriorarea oxidantă, aÅŸa cum este demonstrată de nivelul MDA, este semnificativ crescută la pacientele cu leziuni neoplazice cervicale, atât intraepiteliale, cât ÅŸi infiltrative. O corelaÅ£ie de interes este legătura între infecÅ£ia cu papilomavirusul uman (HPV) ÅŸi modificările de stres oxidativ. InfecÅ£ia genitală cu risc crescut de HPV (HR-HPV), deÅŸi este recunoscută ca principalul factor etiopatogenetic al cancerului de col uterin, nu este în sine suficientă pentru a induce dezvoltarea tumorii. ADN-ul viral integrat poate genera o stare de infecÅ£ie latentă în care nu apare nici replicare virală ÅŸi nici transformarea celulară. Stresul oxidativ în timpul infecÅ£iei virale poate fi un rezultat al răspunsului imun la proteinele virale sau o consecinţă a expresiei genei virale. Stresul oxidativ provoacă leziuni ADN oxidative, care pot facilita integrarea ADN-ului HPV⁽¹⁶⁾.

Pe lângă radicalii liberi care au indus peroxidarea lipidelor ÅŸi denaturarea proteică, ÅŸi lezarea ADN-ului a fost implicată în multe boli, incluzând cancerul. Apărarea antioxidantă celulară joacă un rol important în boala neoplazică pentru a contracara daunele oxidative. Un dezechilibru între sistemele pro- ÅŸi antioxidante generează stresul oxidativ, iar cea mai reactivă specie de oxigen este radicalul hidroxil OH-, care atacă bazele nucleice ale catenelor ADN, cum ar fi guanina, ducând la 8-hidroxi-2-deoxiguanozină (8-OhDG)⁽¹⁷⁾. ProducÅ£ia de markeri de stres oxidativ ÅŸi radicali liberi poate fi corelată cu existenÅ£a unei cantităţi mari de fier. În patologia ginecologică putem întâlni aceaste modificări în cazul existenÅ£ei unei hemoragii, cum ar fi menstruaÅ£ia retrogradă sau leziunile de tip endometrioid⁽¹⁸⁾. Am constatat faptul că leziunea ADN-ului este mai mare la nivelul celulelor tumorale comparativ cu cele neoplazice. De asemenea, cu cât gradul leziunii este mai mare, cu atât se identifică un procent mai mare de celule pozitive. Am observat o creÅŸtere semnificativă progresivă a nivelurilor de 8-OHdG ÅŸi a procentului celulelor pozitive medii de la leziunile cervicale intraepiteliale de grad scăzut ÅŸi până la cele de grad înalt. Valoarea cea mai mare de pozitivitate celulară a fost identificată la nivelul secÅ£iunilor cu carcinom scuamos invaziv.

Mai multe strategii terapeutice, cum ar fi radioterapia ÅŸi terapia fotodinamică, au fost proiectate special pentru a creÅŸte nivelul de ROS în celulele tumorale ÅŸi a determina moartea lor prin stres oxidativ brusc ÅŸi intens. Prin generarea unei supraîncărcari ROS induse terapeutic, în celulele canceroase, pragul oxidativ ce separă supravieÅ£uirea de moarte ar putea fi depăşit. Din cauza activităţii oxidative intrinseci crescute a celulelor canceroase ÅŸi a programării lor defectuoase, sunt necesare mai puÅ£ine ROS suplimentare, comparativ cu celulele normale, pentru declanÅŸarea morÅ£ii celulare. Nivelurile de ROS care sunt citotoxice pentru celulele canceroase induc efecte mai puÅ£in drastice în celulele normale, care au un status oxidativ inferior ÅŸi sunt mai eficiente în repararea leziunilor ROS induse în anumite limite. Cu toate acestea, direcÅ£ionarea Å£intită a terapiei pe bază de stres oxidativ către Å£esutul bolnav reprezintă o prioritate, cu scopul de a proteja Å£esuturile normale împotriva acÅ£iunii nocive a ROS „terapeutice”. Celulele tumorale prezintă diferite susceptibilităţi intrinseci la stresul oxidativ. Un dezavantaj major al terapiilor bazate pe stres oxidativ îl reprezintă rezistenÅ£a remarcabilă a celulelor stem tumorale (CSCS). Aceste celule au capacitatea de a se autoreînnoi, de a se diferenÅ£ia în mai multe linii ÅŸi să iniÅ£ieze tumori, fiind astfel responsabile de creÅŸterea necontrolată a tumorilor, întreÅ£inerea bolii reziduale minime ÅŸi de reapariÅ£ia tumorii după tratament⁽¹⁹⁾. RezistenÅ£a CSCS se bazează pe mecanismele de reparare, controlul ciclului celular, supraexpresia enzimelor antioxidante ÅŸi eliminarea eficientă a radicalilor liberi⁽²⁰⁾.

Diferite reÅ£ele moleculare reglementează CSCS ÅŸi răspunsurile lor adaptative la hipoxie ÅŸi stres oxidativ în tumoră. De exemplu, PI3K/PTEN/AKT/mTOR controlează nivelul ROS în CSCS prin reglarea localizării nucleare a FOXO ÅŸi astfel a supraexpresiei enzimelor antioxidante⁽²¹⁾. Dereglarea căilor de semnalizare redox conferă celulelor tumorale un avantaj de supravieÅ£uire⁽²²⁾. Activarea activităţii factorului de transcripÅ£ie Nrf2, care controlează sistemul antioxidant endogen, ÅŸi scăderea subsecventă a stresului oxidativ în tumorile incipiente ar putea încetini evoluÅ£ia procesului tumoral. În acelaÅŸi timp, date recente arată că eficacitatea chimio- ÅŸi radioterapiei necesită un status oxidativ activat la nivel tumoral, ceea ce sugerează că inhibarea farmacologică a sistemului antioxidant endogen prin inhibarea activităţii Nrf2 poate reprezenta o abordare terapeutică adjuvantă în tumorile solide pentru a controla rezistenÅ£a la terapia antitumorală convenÅ£ională⁽²³⁾.

În concluzie, caracterizarea moleculară a statusului redox în tumorile genitale poate aduce noi informaÅ£ii privind identificarea de noi Å£inte terapeutice ÅŸi pentru estimarea răspunsului la terapiile antitumorale convenÅ£ionale (chimio- ÅŸi radioterapie).  

Acknowledgment: Această lucrare a fost realizată prin programul-nucleu derulat cu sprijinul ANCSI, proiect nr. 16.22.04.04.

Conflict of interests: The authors declare no conflict of interests.