SINTEZE

Tehnici de editare genetică în tratamentul infecţiei cu HIV

 Genetic editing techniques in HIV infection treatment

First published: 09 ianuarie 2018

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/Inf.52.4.2017.1379

Abstract

Genome editing is a type of genetic engineering in which DNA is inserted, deleted or replaced in the genome of a living organism using engineered nucleases, or “molecular scissors”. These nucleases create site-specific double-strand breaks (DSBs) at desired locations in the genome. This technology has many applications both in research, as well as in the possible treatement of genetic diseases or diseases which carry a genetic component.
In the present article we reviewed the three main genetic editing techniques and their employment in the deletion of the CCR5 gene in the cells susceptible to HIV infection or the deletion of HIV proviral DNA in infected cells, as a potential means of treating HIV infection. The molecular editing technologies are Zinc Finger Nucleases (ZFN), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) and Cluster Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9) in the chronological order of their development.
It is premature to make any definitive statements, but it is fair to say that scientist are excited about the great number of possibilities these genetic techniques offer.

Keywords
genetic editing, HIV infection

Rezumat

Editarea genomului este un tip de prelucrare genetică a ADN-ului, prin care se poate realiza inserția, deleția sau înlocuirea unor secvențe din genomul unui organism, cu ajutorul endonucleazelor sintetice, denumite „foarfece moleculare“. Aceste nucleaze clivează acidul nucleic dublu catenar în situsuri specifice. Tehnologia aceasta poate fi aplicată atât în cercetare, cât și ca potențial tratament pentru boli genetice sau care au o componentă genetică. 
În articolul de față am prezentat cele trei tehnici principale de editare genetică și utilizarea lor în deleția genei CCR5 în celulele susceptibile la infecția cu HIV sau deleția ADN-ului proviral din celulele infectate cu HIV, ca un posibil tratament al infecției cu HIV. Tehnologiile de editare moleculară concepute până acum sunt Zinc Finger Nucleases (ZFN), Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALEN) și Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR/Cas9), în ordinea cronologică a implementării lor.
Este încă devreme pentru a face afirmații certe, însă oamenii de știință sunt entuziasmați în legătură cu numărul mare de posibilități pe care aceste tehnici genetice le oferă.

Editarea genetică presupune inserția, deleția sau înlocuirea unei porțiuni de ADN, utilizând nucleaze sintetizate în laborator (artificiale), cunoscute sub denumirea de „foarfece moleculare“(1). În momentul actual există trei tipuri de asemenea „foarfece moleculare“, în ordinea apariției: ZFN (Zinc Finger Nucleases), TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) și CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR associated protein 9)(1). De-a lungul timpului, cercetătorii au încercat utilizarea fiecăruia dintre cele trei sisteme de editare genetică pentru a trata și chiar a vindeca infecția cu HIV(1).

ZFN sunt formate din două domenii, unul care recunoaște triplete de nucleotide din secvențe de ADN specifice (ZFP – Zinc Finger Proteins) și unul cu activitate nucleazică nespecifică (FokI), care clivează ADN-ul dublu catenar(1). Astfel, sunt introduse puncte de clivare în molecula de ADN, pe care celula le va repara(1). În majoritatea cazurilor vor fi introduse mutații în gena respectivă, care vor duce la inactivarea acesteia(1). Astfel, se încearcă folosirea acestei tehnologii în inactivarea genei care codifică pentru coreceptorul pentru beta-chemokine (CCR5), coreceptor necesar tulpinilor HIV macrofagotrope (majoritare în infecțiile in vivo) pentru a pătrunde în organismul uman și a declanșa infecția. Cercetătorii au ales să editeze această genă din mai multe motive(1). În primul rând, există persoane homozigote pentru deleția de 32 de perechi de baze a genei CCR5 (delta 32/delta 32) care sunt rezistente la infecția cu HIV(1). Persoanele heterozigote pentru această deleție (delta 32) și care se infectează cu HIV prezintă o progresie mult mai lentă a infecției către stadiul terminal, Sindromul Imunodeficienței Umane Dobândite (SIDA)(1). Nu în ultimul rând, există un singur pacient, care suferea de leucemie mieloidă acută și infecție HIV-1, căruia i-au fost transplantate celule stem de la un donator homozigot pentru deleția delta 32 CCR5. În urma transplantului, pacientul a întrerupt terapia antiretrovirală, iar cantitatea de ARN HIV-1 și ADN proviral a fost nedetectabilă în diverse produse biologice(2). Scopul studiului a fost de a induce artificial deleția homozigotă delta 32 CCR5 în limfocitele T CD4+ și ulterior de a infuza aceste celule la pacienții cu infecție cu HIV cronică și viremie nedetectabilă, aflați sub tratament antiretroviral(2). Rezultatul a fost o creștere a numărului de limfocite T CD4+, persistența pe termen lung a limfocitelor T CD4+ modificate la nivelul genei CCR5 și neimunogenicitatea acestora(2). După 2-4 săptămâni de la întreruperea tratamentului cu antiretrovirale însă, viremia a devenit detectabilă la 66,7% dintre pacienți(1).

TALEN au un mecanism de acțiune foarte asemănător cu cel al ZFN, însă au avantajul că fiecare domeniu efector (TALE) recunoaște un singur nucleotid(3). Astfel, sinteza TALEN este mai facilă decât cea a ZFN, care erau capabile să recunoască doar triplete de nucleotide(3). Au fost efectuate studii în care s-a încercat editarea genetică a celor doi coreceptori HIV, CCR5 și CXCR4 (coreceptorul pentru alfa-chemokine), precum și a proteinei p75, cu rol în facilitarea integrării ADN-ului proviral în genomul celulei-gazdă(3). Cu toate acestea, au fost întâmpinate dificultăți care țin de mărimea acestui sistem de editare genetică, care pune probleme în găsirea unei modalități de a-l transloca în celula-gazdă, precum și imunogenicitatea acestuia, proteinele efectorii TALE provenind de la bacteria Xanthomonas(3).

Cel mai recent sistem de editare genetică conceput este reprezentat de CRISPR/Cas9(4). Acesta presupune editarea unei secvențe specifice de ADN de către endonucleaza Cas9, ghidată de o moleculă scurtă de ARN-ghid (guide ARN; gARN), complementară cu secvența care va fi excizată(4). Acest sistem este superior celorlalte două prezentate anterior, deoarece recunoașterea secvenței specifice de ADN se face foarte simplu și eficient, pe baza complementarității bazelor azotate, cu ajutorul gARN, care poate fi sintetizat astfel încât să recunoască orice secvență de ADN.Eficiența transferului este net superioară tehnicilor ZFN și TALEN, în celula-țintă este introdus ARN care codifică pentru endonucleaza Cas9 și gARN și pot fi introduse mutații în mai multe gene în același timp, prin introducerea mai multor tipuri de gARN(4). Se încearcă și prin această tehnică inactivarea genei CCR5 în limfocitele T CD4+. De asemenea, este investigată posibilitatea de a exciza ADN-ul proviral HIV-1 din celulele infectate, inclusiv din rezervoarele celulare, acolo unde ADN-ul proviral rămâne în stare dormantă, făcând astfel imposibilă vindecarea infecției(4). S-au obținut rezultate optimiste atunci când tehnica a fost aplicată asupra șoarecilor transgenici HIV, dar și asupra liniilor celulare de limfocite T CD4+(4). Cu toate acestea, există riscul ca sistemul CRISPR/Cas9 să introducă mutații în ADN-ul proviral care să îl facă imposibil de recunoscut și de excizat de către gARN și Cas9(4). De asemenea, genomul HIV este constituit din aproximativ 10 kb, iar gARN poate recunoaște doar 20 bp, așadar sunt mii de situsuri la nivelul ADN-ului proviral din celulele infectate aflate în stare latentă(4). Nu în ultimul rând, tehnica trebuie gândită în așa fel încât să poată fi folosită în toate celulele din organism care conțin ADN proviral, inclusiv în sanctuare celulare, cum ar fi sistemul nervos central(4).

În concluzie, deși rezultatele inițiale sunt promițătoare, există încă suficiente obstacole care trebuie depășite pentru ca tehnologia editării genetice să își găsească utilitatea clinică. 

Conflict of interests: The author declares no conflict of interests.

Bibliografie

  1. Tebas P, Stein D, Tang WW, et al. Gene Editing of CCR5 in Autologous CD4 T Cells of Persons Infected with HIV. N Engl J Med. 2014;370(10):901-10. Disponibil la: http://www.nejm.org/doi/10.1056/NEJMoa1300662
  2. Hütter G, Nowak D, Mossner M, et al. Long-Term Control of HIV by CCR5 Delta32/Delta32 Stem-Cell Transplantation. N Engl J Med. 2009;360(7):692-8. Disponibil la: http://www.nejm.org/doi/abs/10.1056/NEJMoa0802905
  3. Benjamin R, Berges BK, Solis-Leal A, et al. TALEN gene editing takes aim on HIV. Hum Genet. NIH Public Access. 2016;135(9):1059-70. Disponibil la: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27170155
  4. Soriano V. Hot News: Gene Therapy with CRISPR/Cas9 Coming to Age for HIV Cure. AIDS Rev. 2017;19(3):167-72. Disponibil la: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29019352