Noi molecule alergenice în imunoanaliza multiplex macroarray de ultimă generație

Detectarea IgE alergen-specifice serice este pilonul central în diagnosticul alergiilor IgE-mediate, confirmând sau excluzând sensibilizarea la o gamă largă de surse alergenice. Deși extractele naturale tradiționale sunt încă utilizate pe scară largă, acestea prezintă limitări legate de variabilitatea în compoziție și concentrație, ceea ce poate genera incertitudini.

Diagnosticul rezolvat pe componente din alergologia moleculară depășește aceste bariere prin utilizarea moleculelor definite, permițând o abordare de precizie cu imunoterapie alergenică optimizată. Tehnologia de tip multiplex macroarray, precum testul ALEX (Allergy Explorer), oferă un profil complet de reactivitate IgE dintr-o singură probă minimă de ser.

Imunoanaliza IgE multiplex ALEX³ Allergy Xplorer (ALEX^®, MacroArray Diagnostics, Viena, Austria) este o platformă de tip macroarray IgE bazată pe tehnologia ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), care include în prezent cel mai cuprinzător panel de molecule alergenice recombinate și componente alergenice naturale înalt purificate (n = 218), alături de extracte alergenice naturale (n = 82) în același test, însumând în total 300 de specificități (tabelul 1). Acest test imunoalergologic de diagnostic molecular este utilizat pentru detecția simultană in vitro a IgE alergen-specifice serice în mod cantitativ (în intervalul 0,3-50 kU_A/L) și a IgE totale serice (tIgE) cantitativ în intervalul 2-1000 kU/L (semicantitativ între 1001 și 2500 kU/L).

Extractele alergenice naturale și componentele moleculare (r = recombinate; n = naturale înalt purificate), cuplate cu nanoparticule activate (nanosfere de polistiren) pentru menținerea complexității epitopilor (tehnologie de ultimă generație cu nanoparticule), sunt dispuse sistematic pe suport solid reprezentat de o membrană de nitroceluloză. Acest test multiplex utilizează spoturi în format macroarray.

Alergenii legați la nanoparticule reacționează cu IgE specifice din proba de ser sau plasmă a pacientului, după care se adaugă anticorpi de detecție anti-IgE umani marcați cu fosfatază alcalină pentru a forma un complex. Protocolul integrează un inhibitor/blocant CCD (determinanți carbohidrați cu reactivitate încrucișată), crescând astfel specificitatea rezultatelor testului. Prin utilizarea acestui inhibitor CCD în timpul incubației serului în procedura standard a testului ALEX³, numărul rezultatelor IgE specific fals pozitive este redus semnificativ.

Ulterior se adaugă substratul NBT/BCIP (nitro albastru tetrazoliu/5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat), iar enzima legată de anticorp îl transformă într-un precipitat colorat insolubil. În final, achiziția și analiza imaginilor sunt efectuate folosind fie un sistem automatizat, fie unul manual, prin intermediul unui software de analiză Raptor.

Bazată pe analiza a aproximativ 400000 de rezultate din practica clinică reală obținute prin testul ALEX², cea mai recentă actualizare din 2025 a ALEX include 52 de alergeni noi, selectați pentru a extinde acoperirea expozomului global și pentru a crește sensibilitatea diagnostică. Noii alergeni includ ciclofiline, α-Gal și markeri adiționali proveniți din surse respiratorii, alimentare și veninuri de himenoptere. Alergenii cu prevalență scăzută sau redundanți au fost eliminați.

Această abordare bazată pe big data permite un diagnostic mai precis, diferențierea sensibilizărilor autentice de cele încrucișate și o evaluare îmbunătățită a riscului clinic. Articolul detaliază noile molecule și extracte, evidențiind relevanța acestora în alergologia moleculară, și include reprezentări grafice și tabelare pentru a ilustra evoluția panelului de alergeni.

Lansarea ALEX³ reprezintă un salt tehnologic ghidat de analiza big data a rezultatelor reale, care permite:

• optimizarea panelului – eliminarea alergenilor redundanți sau cu relevanță clinică scăzută, panou complex de ultimă generație având 218 molecule și 82 de extracte alergene, acoperind 85 de familii de proteine și 107 alergeni exclusivi;
• personalizarea regională – includerea unor markeri specifici de expozom geografic specific;
• standardizarea –  înlocuirea progresivă a extractelor naturale cu molecule recombinate sau componente naturale purificate.

Pentru o informare practică și o bună claritate, discutăm în continuare principalele molecule nou adăugate în ALEX³, structurate în funcție de sursa și impactul lor clinic.

Biomarkerii moleculari pentru sensibilizarea mediată IgE la aeroalergeni sunt utilizați pentru diagnosticul molecular al alergiilor respiratorii, identificarea markerilor de sensibilizare primară versus panalergeni fiind esențială pentru stabilirea indicației de imunoterapie cu alergen.

Nou introdusele molecule chitinaze din corpul acarienilor din praful de casă cresc acuratețea diagnosticului în alergiile la praf de casă, oferind un profil detaliat de sensibilizare, inclusiv în context de dermatită atopică. rDer f 15 reprezintă chitinaza care conține un domeniu C-terminal peritrofin-A-similar. rDer f 18 reprezintă proteina asemănătoare chitinazei necatalitice care conține un domeniu C-terminal asemănător peritrofinei-A.

Alte moleculele alergenice de origine animală nou introduse în panelul de diagnostic sunt: rMes a 1 care reprezintă lipocalina din epitelul de hamster auriu (Mesocricetus auratus), marker de sensibilizare primară care confirmă o alergie reală și nu o reacție secundară; rApi m 2 (albină) și rDol m 2 (viespe) care reprezintă hialuronidaze din venin de himenoptere, utilizate pentru diferențierea sensibilizării autentice de cross-reactivitate, prevenind astfel prescrierea eronată a imunoterapiei cu alergen.

Molecula alergenică fungică rAsp f 8 reprezintă proteina ribozomală cu rol în aspergiloza bronhopulmonară alergică (ABPA). Deși rAsp f 8 este biomarker important, diagnosticul de ABPA se bazează mai ales pe un panel de molecule incluzând și rAsp f 4 și rAsp f 6.

Molecule alergenice din polenuri nou introduse sunt: nZea m 1 care reprezintă β-expansina din polen de porumb Zae mays (graminee din subfamilia Panicoideae), alergen major (Grupul 1 de alergene din polen de graminee), care este marker de sensibilizare primară; rBet v 7 care reprezintă ciclofilina din polen de mesteacăn Betula verrucosa cu rol de panalergen vegetal, care ajută la clarificarea reactivităților încrucișate multiple; rQue a 1 care reprezintă o proteină ce aparține familiei PR-10, marker de sensibilizare primară pentru polenul de stejar Quercus alba, crucială pentru indicația de imunoterapie alergen-specifică; nOle e 7 care reprezintă o proteină de transfer lipidic nespecifică (nsLTP) din polen de măslin Olea europaea, un marker de severitate, fiind esențial pentru pacienții din zonele cu expunere mare la polen de măslin din regiunea mediteraneeană, unde este asociat cu reacții clinice complexe; rSal k 5 care reprezintă o proteină de tip Ole e 1 din polen de ciulin Salsola kali, a cărei includere în panelul multiplex îmbunătățește semnificativ sensibilitatea diagnosticului pentru polinozele la buruieni.

Alte moleculele alergenice de origine vegetală nou introduse în panelul de diagnostic multiplex sunt: rPers a 1 care reprezintă chitinaza de clasa I din avocado (Persea americana), alergen major responsabil de reacții severe și de reactivitatea încrucișată cu latexul; rMus a 2 (chitinază de clasa I) și rMus a 5 (β-1,3-glucanază) care reprezintă molecule din banană (Musa acuminata), care permit corelarea precisă a sensibilizării la latex cu simptomele clinice alimentare; rTri a 36 (glutenină cu greutate moleculară mică) și rTri a 37 (α-purotionină) care reprezintă markeri de risc din grâu (Triticum aestivum) asociați cu anafilaxia indusă de efort, Tri a 37 fiind un indicator specific de severitate; rPis s 1 (vicilină), rPis s 2 (convicilină) și rPis s 3 (nsLTP1) care reprezintă proteine de stocare din mazăre (Pisum sativum), markeri critici pentru evaluarea riscului de reacții severe la leguminoase; rLen c 1 (γ-vicilină) și rLen c 3 (nsLTP1) care reprezintă molecule din linte (Lens culinaris), utilizate pentru stratificarea riscului, Len c 3 fiind asociată cu riscul de anafilaxie din cauza rezistenței la digestie; nMac i 1.0101 care reprezintă α-hairpinina din nuca de macadamia, un alergen emergent utilizat în evaluarea riscului de reacții severe; nPru du 6 care reprezintă amandina (11S globulină) din migdală (Prunus dulcis), proteină de stocare termostabilă esențială pentru indicarea riscului de reacții sistemice; rHel a 3 care reprezintă proteină de transfer lipidic nespecifică (nsLTP1) din semințele de floarea-soarelui (Helianthus annuus); rApi g 7 care reprezintă defensina din țelină (Apium graveolens), utilizată pentru stratificarea riscului și clarificarea reactivității încrucișate cu polenul de pelin (pacienții sensibilizați la Api g 7 sunt adesea cosensibilizați la Art v 1, alergenul major al polenului de Artemisia vulgaris).

Moleculele alergenice alimentare de origine animală nou introduse sunt: rBos d 9, rBos d 10, rBos d 11 și nBos d 12 care reprezintă fracțiunile cazeinei (αs1, αs2, β și respectiv κ ale cazeinei) din laptele de vacă, markeri termostabili care permit predicția toleranței la produsele lactate procesate termic; naturalα-Gal care reprezintă carbohidratul galactoză-1,3-galactoză, esențial pentru diagnosticul alergiei la carnea roșie generată de mușcături de căpușe; rGal d 7 care reprezintă lanțul ușor al miozinei din carnea de pui, marker major de sensibilizare primară; rPen m 3 care reprezintă lanțul ușor al miozinei din crevete, util în evaluarea reactivităților încrucișate complexe între crustacee, insecte și carnea de pui; nSal s 6 care reprezintă colagenul de tip I din somon (Salmo salar), identificat ca alergen ascuns în produse alimentare procesate și produse nonalimentare.

Sistemul ALEX³ are mai multe beneficii, pe care le prezentăm în continuare.

• Diferențiere precisă: distinge între cosensibilizare (alergii concomitente a surse multiple) și cross-reactivitate (reacții încrucișate la proteine similare din surse diferite).
• Eliminarea interferențelor: neutralizarea CCD (determinanți carbohidrați cu reactivitate încrucișată) elimină rezultatele fals pozitive.
• Evaluarea riscurilor: identificarea proteinelor stabile termic (de exemplu, nsLTP, 2S albumine) versus cele instabile (de exemplu, PR-10) ajută la estimarea severității unei potențiale reacții alergice.
• Eficiență în laborator: automatizarea prin platformele MAX reduce timpul de lucru și erorile manuale, oferind rezultate reproductibile.

Imunoanaliza ALEX³ marchează o nouă etapă în alergologia moleculară, unde diagnosticul in vitro nu mai este doar un test „pozitiv sau negativ”, ci un profil complex de sensibilizare moleculară detaliată a pacientului. Integrarea datelor multiple și complexe în designul panelului multiplex asigură relevanță extinsă la nivel european, transformând managementul alergiei într-un proces cu adevărat personalizat. Evoluția către molecule alergenice definite, structurate în hărți detaliate de sensibilizări mediate IgE, poate reduce necesitatea testelor de provocare orală riscante și optimizează selecția pacienților pentru imunoterapia cu alergen.

Autor corespondent:  Mariana Preda, e-mail: mariana.preda@umfcd.ro

CONFLICT OF INTEREST: none declared.

FINANCIAL SUPPORT: none declared.

This work is permanently accessible online free of charge and published under the CC-BY.