Iod povidona demonstrează activitate virucidă in vitro rapid instalată împotriva SARS-CoV-2, virusul responsabil de apariţia COVID-19

Introducere

Boala coronavirus 2019 (COVID-19), cauzată de SARS-CoV-2, a fost declarată pandemică de OrganizaÅ£ia Mondială a Sănătăţii (OMS) în data de 11 martie 2020⁽¹⁾. Numărul infecÅ£iilor a crescut exponenÅ£ial într-o pe­rioadă scurtă⁽²⁾. Până la 22 iunie 2020, virusul s-a răspândit rapid ÅŸi a infectat cel puÅ£in 8,95 milioane de oameni la nivel mondial, provocând peste 468.000 de decese⁽³⁾. SARS-CoV-2 este un virus ARN anvelopat mo­no­ca­tenar, cu polaritate pozitivă, ÅŸi aparÅ£ine aceleiaÅŸi clase de beta-coronavirusuri ca SARS-CoV ÅŸi Sindromul Respirator al Orientului Mijlociu (MERS)-CoV, res­pon­sa­bile de epidemiile SARS din 2003 ÅŸi respectiv MERS din 2012^(4,5).

Dovezile actuale indică faptul că transmiterea de la om la om are loc în principal prin picături respiratorii din tuse sau strănut ÅŸi/sau prin contact fizic⁽⁶⁾. Deoarece virusul poate persista pe suprafeÅ£e contaminate timp de mai multe zile⁽⁷⁾, infecÅ£ia poate să apară indirect prin transferul de virus de la aceste suprafeÅ£e sau mâini către mucoasa gurii, nasului sau ochilor. Astfel, măsurile de control al infecÅ£iilor, cum ar fi dezinfectarea suprafeÅ£elor ÅŸi o bună igienă personală ÅŸi a mâinilor, sunt importante pentru a limita răspândirea virusului.

Iod povidona (PVP-I; polivinilpirolidona iodată) este un complex solubil în apă de povidonă, o moleculă purtătoare, şi iod, care are o activitate microbicidă puternică. Formulările pe bază de PVP-I au fost utilizate pe scară largă timp de peste 60 de ani datorită activităţii antimicrobiene cu spectru larg şi profilului de siguranţă bine determinat^(8,9).

PVP-I se află pe lista medicamentelor esenÅ£iale în­toc­mi­tă de OMS, care identifică medicamente im­por­tan­te necesare unui sistem funcÅ£ional de asistenţă medicală. Apa de gură pe bază de PVP-I este, de ase­me­nea, in­clu­să în planul de cercetare ÅŸi dezvoltare al OMS pen­tru terapii experimentale îm­po­triva COVID-19, de aceea ar fi important să se de­mon­stre­ze activitatea sa antivirală directă împotriva vi­ru­su­lui⁽¹⁰⁾. ÃŽn plus faţă de activitatea largă antibacteriană ÅŸi antifungică, PVP-I a demonstrat o activitate in vitro îm­po­tri­va unei serii de virusuri⁽¹¹⁾, inclusiv SARS-CoV⁽¹²⁾ ÅŸi MERS-CoV⁽¹³⁾. ÃŽn acest studiu am evaluat activitatea vi­ru­cidă a patru produse pe bază de PVP-I împotriva SARS-CoV-2, utilizând o testare cantitativă după un timp de expunere de 30 de secunde.

Metodă

Patru produse pe bază de PVP-I [Betadine® soluţie cu­ta­nată antiseptică (PVP-I 10%), Betadine® soluţie cu­ta­nată antiseptică de curăţare (PVP-I 7,5%), Betadine® gargarism şi apă de gură (PVP-I 1,0%) şi Betadine® spray pen­tru gât (PVP-I 0,45%)] au fost testate la facilitatea de pro­duc­ţie cu nivel 3 de biosiguranţă animală de la Şcoala Me­di­cală Duke-NUS din Singapore. Betadine® gargarism şi apă de gură a fost testată atât nediluată, cât şi în diluţie 1:2.

Produsele pentru testare au fost furnizate de către Mundipharma Singapore Holding. Activitatea virucidă a produselor pe bază de PVP-I faţă de SARS-CoV-2 a fost evaluată într-o analiză ce a determinat timpul de inac­tivare a virusului, adaptând protocolul din me­to­do­lo­gia de testare a dezinfectanÅ£ilor EN14476, care a fost utilizată anterior pentru a testa eficacitatea pro­duselor Betadine® în cazul SARS-CoV ÅŸi MERS-CoV. O reducere ≥4 log₁₀ (99,99%) a titrului viral re­prezintă o activitate virucidă eficientă conform stan­dardelor europene^(9,12). Acest articol nu conÅ£ine studii cu subiecÅ£i umani sau cu animale, efectuate de vreunul dintre autori.
 

Cultura virală

SARS-CoV-2 (hCoV-19/Singapore/2/2020) a fost propagat în celulele Vero-E6 (American Type Culture Collection). Celulele-gazdă Vero-E6 au fost menÅ£inute în mediul Dulbecco Eagle modificat, conÅ£inând 5% ser fetal bovin (DMEM-5% FBS). Pentru a pregăti stocurile de virus, monostraturile cu celule confluente au fost infectate cu SARS-CoV-2 ÅŸi incubate la 37°C, 5% CO₂, timp de până la 7 zile. Când efectele citopatice (CPE) au fost evidente microscopic, supernatantul a fost recoltat, clarificat prin centrifugare ÅŸi păstrat la -80°C.

Test de citotoxicitate a PVP-I

Citotoxicitatea PVP-I a fost testată prin incubarea celulelor Vero-E6 neinfectate cu câte zece diluţii seriale ale produselor de test PVP-I în FEM DMEM-5%. După incubarea la 37°C timp de patru zile, au fost observate CPE la fiecare diluţie pentru a determina concentraţia cea mai mică de PVP-I, la care efectele citotoxice au lipsit.

PVP-I – testul timpului necesar de inactivare a virusului

Expunerea virusului la produsele pe bază de PVP-I a fost efectuată la 21°C timp de 30 de secunde, pentru a eva­lua eficacitatea dezinfectantului, aÅŸa cum s-a descris an­te­rior⁽¹³⁾. S-a amestecat o cantitate de 100 µl de virus cu 700 µl produs de test PVP-I, în prezenÅ£a a 200 µl de so­lu­ţie salină tamponată cu fosfat (PBS) care conÅ£ine 0,3 g/l BSA ca substanţă interferentă.

Au fost incluse controalele virusului cu 700 µl de PBS în locul produselor pe bază de PVP-I. După timpul de contact prevăzut, reacÅ£ia PVP-I a fost oprită prin transferul de 100-µl alicote la 900 µl DMEM-5% FBS. Imediat, s-au efectuat zece diluÅ£ii seriale ÅŸi s-au utilizat 100 µl din fiecare diluÅ£ie pentru a inocula celulele Vero-E6 (în patru exemplare) într-o placă cu microtitru cu 96 de godeuri. Datorită titrării imediate, nu s-a putut produce niciun efect secundar al produsului de testare, aÅŸa cum s-a descris anterior⁽⁹⁾. Plăcile au fost incubate la 37°C timp de patru zile înainte de evaluarea CPE. Titrurile virale au fost calculate ca doză medie infecÅ£ioasă a culturii Å£esuturilor (TCID50/ml), folosind metoda Spearman‑Kärber^(14,15).

Rezultate

Testul timpului necesar pentru inactivarea virusului a fost efectuat după prima evaluare a citotoxicităţii produselor pentru celulele Vero-E6. Soluţia cutanată antiseptică, dezinfectantul pentru mâini, spray-ul pen­tru gât şi gargarismul/apa de gură nu au fost citotoxice pentru Vero-E6 la diluţiile ≥1:100 şi soluţia cutanată antiseptică de curăţare la diluţiile ≥1:1000. Acest lucru a fost luat în considerare atunci când s-a efectuat testul de inactivare a virusului.

Testarea iniÅ£ială a fost efectuată la 120 de secunde pentru a evalua eficacitatea diferitelor produse pe bază de PVP-I împotriva SARS-CoV-2 ÅŸi pentru a optimiza testul (tabelul 1). Nu au fost observate CPE după expunerea SARS-CoV-2 la produsele pe bază de PVP-I. Datorită citotoxicităţii produselor în celulele Vero-E6, limita de detectare a testului a fost de 3x10³ TCID₅₀/ml. Acest lucru a demonstrat că toate produsele de testare au fost eficiente împotriva SARS-CoV-2 după 2 minute. Pentru a determina activitatea virucidă a produsului (reducerea cu ≥4 log₁₀ a titrurilor virale), eficacitatea produselor pe bază de PVP-I împotriva SARS-CoV-2 a fost testată la un timp de expunere de 30 s, conform Ghidurilor AgenÅ£iei Europene pentru Produse Chimice (ECHA)⁽¹⁶⁾, pentru a demonstra eficacitatea virucidă a dezinfectanÅ£ilor pentru utilizare în spitale ÅŸi acasă.

Toate produsele pe bază de PVP-I testate la 30 de secunde au demonstrat o reducere cu ≥4 log₁₀ a ti­tru­ri­lor SARS-CoV-2, corespunzând unei inactivări virale de ≥99,99% pentru toate produsele testate, indicând o activitate virucidă rapidă⁽¹⁶⁾ ÅŸi, de asemenea, res­pec­tând reperele de timp ECHA pentru eficacitatea dez­in­fec­tanÅ£ilor (tabelul 1).
 

Discuţie

ÃŽn prezent, nu sunt stabilite terapii eficace sau vac­ci­nuri împotriva infecÅ£iei cu SARS-CoV-2, în ciuda multitudinii de studii clinice în curs de desfăşurare⁽¹⁷⁾. Prin urmare, tra­ta­mentul pentru pacienÅ£ii cu COVID-19 se bazează în cea mai mare parte pe tratament de susÅ£inere, ventilaÅ£ie me­ca­nică ÅŸi/sau medicamente utilizate anterior îm­po­tri­va altor coronavirusuri⁽¹⁷⁾. La fel ca SARS-CoV, SARS-CoV-2 părea să se răspândească iniÅ£ial prin trans­mi­terea picăturilor ÅŸi prin contact direct/indirect cu persoane infectate simptomatice. Cu toate acestea, per­soa­nele infectate, asimptomatice ÅŸi cele presimptomatice, cu SARS-CoV-2 pot transmite virusul⁽¹⁸⁾. Mai mult, virusul pare să fie mult mai contagios în comparaÅ£ie cu SARS-CoV⁽¹⁹⁾.

Pe lângă distanÅ£area fizică, măsurile preventive, precum igiena personală ÅŸi dezinfectarea frecventă a suprafeÅ£elor atinse în permanenţă în spaÅ£iile publice, alături de măsurile luate privind sănătatea publică sunt inter­ven­ţii nonterapeutice importante pentru a reduce ris­cul de transmitere de la persoană la persoană în ca­drul comunităţii ÅŸi pentru a proteja angajaÅ£ii din sis­te­mul sanitar. Formulările testate au diferite roluri com­ple­men­tare în controlul infecÅ£iilor, inclusiv igiena mâinilor ÅŸi igiena orală. ÃŽn primul rând, protocoalele recomandate de OMS⁽⁶⁾ în ceea ce priveÅŸte igiena mâinilor pot fi aug­men­tate prin utilizarea de dezinfectanÅ£i cu activitate do­vedită in vitro împotriva SARS-CoV-2, aÅŸa cum s-a de­mon­strat cu PVP-I în acest studiu.

Un studiu anterior de simulare a igienei mâinilor a demonstrat o eficacitate in vivo superioară a PVP-I în comparaÅ£ie cu săpunul moale sau clorhexidina împotriva norovirusului murin nepatogen (MNV)⁽²⁰⁾. MNV, un virus neanvelopat, a fost utilizat ca model de virus-test în simulări in vivo din motive de biosecuritate, ÅŸi se ÅŸtie că este mai rezistent la antiseptice decât virusurile an­velopate, cum ar fi coronavirusurile⁽²⁰⁾.
 

ÃŽn al doilea rând, având în vedere potenÅ£ialul pen­tru infecÅ£ia cu SARS-CoV-2 prin mucoasa buca­lă ÅŸi nazală, pe lângă măşti, măsurile de igienă res­pi­ra­torie suplimentară, precum spray-urile pentru gât sau soluÅ£iile pentru gargară, se consideră că re­duc riscul de transmitere a SARS-CoV-2 pe aceste căi⁽⁹⁾. Ghiduri ale mai multor organizaÅ£ii, inclusiv Aso­ciaÅ£ia Dentară Australiană ÅŸi Centrele din SUA pen­tru Controlul ÅŸi Prevenirea Bolilor, referitoare la COVID-19, au recomandat utilizarea spălăturilor bu­cale preprocedural cu produse precum PVP-I^(21,22). Un studiu realizat în Japonia a arătat că, la pacienÅ£ii cu boli respiratorii cronice, incidenÅ£a episoadelor de exa­cerbare acută a infecÅ£iilor respiratorii cronice a scăzut semnificativ după începerea utilizării regulate a iod povidonei pentru gargară⁽²³⁾. Studii recente au arătat că SARS-CoV-2 este mai contagios în stadiile precoce ale bolii, iar transmiterea are loc mai ales la nivelul tractului respirator superior^(24,25). Luând în considerare aceÅŸti factori, atât spălarea frecventă a mâinilor, cât ÅŸi igiena orală prin gargară ar putea ajuta la reducerea la minimum a riscului de infecÅ£ii⁽²⁶⁾.

Un studiu recent a testat stabilitatea SARS-CoV-2 în diferite condiÅ£ii de mediu, inclusiv expunerea la iod povidonă ÅŸi la alÅ£i dezinfectanÅ£i, pentru 5, 15 ÅŸi 30 de minute⁽⁷⁾. Rezultatele au arătat că SARS-CoV-2 ar putea rămâne viabil timp de 6-7 zile pe unele suprafeÅ£e (oÅ£el inoxidabil ÅŸi plastic), dar că ar putea fi inactivat de o serie de dezinfectanÅ£i obiÅŸnuiÅ£i. Virusul a fost nedetectabil după o perioadă de expunere de minimum 5 minute la iod povidonă (7,5%), indicând astfel o po­ten­ţială utilizare a acesteia din urmă în cadrul pro­ce­­durilor de dezinfecÅ£ie⁽⁷⁾. Studiile anterioare care au tes­tat eficacitatea produselor cu iod povidonă în eli­mi­na­rea SARS-CoV ÅŸi MERS-CoV au demonstrat ac­ti­vi­ta­te virucidă rapidă în prezenÅ£a unor substraturi in­ter­fe­ren­te cum sunt eritrocitele, pentru a simula con­ta­mi­na­rea organică (condiÅ£ii neigienice). Nu a fost ob­ser­va­tă nicio diferenţă în eliminarea virusurilor în con­di­ţii igienice versus neigienice, indicând faptul că sub­stan­ţele interferente nu determină reducerea ac­ti­vi­tă­ţii antivirale a iod povidonei^(9,13).

ÃŽn aceste studii, iod povidona a demonstrat inactivarea rapidă (reducere log₁₀ a titrurilor virale ≥4) a SARS‑CoV ÅŸi MERS-CoV într-un timp de contact de 15 secunde.

Concluzii

Activitatea virucidă rapidă a iod povidonei împotriva SARS-CoV-2, precum şi spectrul larg al acţiunii anti­mi­cro­biene sugerează importanţa sa în controlul infecţiilor. Ca o mă­sură de protecţie suplimentară echipamentului de pro­tecţie personală (Personal Protective Equipment; PPE), aceste produse pot contribui la reducerea trans­mi­terii bolii.

Iod povidona este uşor de administrat şi este utilizată atât în spitale, cât şi în comunităţi, de peste 60 de ani, putând fi astfel uşor integrată în protocoalele existente pentru controlul infecţiilor.

Produsele pe bază de iod povidonă pot face parte din măsurile de control al infecţiilor în timpul pandemiei de COVID-19^{(27–29)}.

În concluzie, utilizarea produselor pe bază de iod po­vi­do­nă poate spori măsurile de igienă şi sănătate pentru a re­du­ce răspândirea COVID-19 în colectivităţi.   n

MULŢUMIRI. Adresăm mulţumiri echipei Duke-NUS Medical School ABSL3 pentru managementul logistic.

Finanţare. Acest studiu, suportul editorial şi taxele aferente publicării acestui manuscris au fost finanţate de Mundipharma Singapore Holding Pte. Limited.

Asistenţa editorială. Asistenţa editorială în pregătirea acestui articol a fost oferită de Sen Kwan Tay, Tech-Observer Asia-Pacific Pte Ltd.

Drepturi de autor. Toţi autorii menţionaţi corespund criteriilor International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE) privind drepturile de autor pentru acest studiu şi îşi asumă responsabilitatea pentru integritatea prezentei lucrări în totalitatea ei şi şi-au dat acordul pentru publicarea acestei versiuni.

Contribuţiile autorilor. Danielle E. Anderson, Maren Eggers, Harsha Arumugam, Abhishek Ananthanarayanan, Timothy M. Jenkins şi Yacine Hadjiat au realizat designul studiului şi au coordonat activităţile de cercetare. Danielle E. Anderson, Velraj Sivalingam şi Adrian Eng Zheng Kang au condus experimentele. Danielle E. Anderson, Velraj Sivalingam şi Adrian Eng Zheng Kang au efectuat analizele. Abhishek Ananthanarayanan, Harsha Arumugam, Yacine Hadjiat, Timothy M. Jenkins, Maren Eggers şi Danielle E. Anderson au redactat documentul.

Publicare prealabilă. O versiune fără revizuire de specialitate a acestui articol a fost disponibilă în avans, începând cu data de 10 iunie 2020, la adresa ResearchSquare: https://www.researchsquare.-com/article/rs-34544/v1.

Declararea conflictelor de interese. Abhishek Ananthanarayanan, Harsha Arumugam, Timothy M. Jenkins şi Yacine Hadjiat sunt angajaţi ai Mundipharma. Danielle E. Anderson, Velraj Sivalingam şi Adrian Eng Zheng Kang au încheiat contracte de prestări servicii cu Mundipharma pentru acest studiu. Maren Eggers este consultant şi lector pentru Mundipharma.

Conformitatea cu ghidurile de etică. Acest articol nu conţine studii efectuate pe animale sau subiecţi umani.

Disponibilitatea datelor. Toate datele generate sau ana­lizate în timpul acestui studiu sunt incluse în articolul pu­bli­cat sau sunt disponibile sub formă de fişiere cu in­for­ma­ţii suplimentare.

Acces liber. Acest articol este sub licenţa internaţională Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0, care permite orice utilizare necomercială, partajare, adaptare, distribuire şi reproducere în orice mediu sau format, în condiţiile în care se face referirea cuvenită la sursă şi autori, se pune la dispoziţie un link către licenţa privind drepturile de autor şi se menţionează dacă au fost efectuate modificări. Imaginile sau alte materiale ale unor terţe părţi sunt incluse în licenţa privind drepturile de autor ale articolului, dacă nu există o altă menţiune. În cazul unui material care nu este inclus în licenţă, iar utilizarea respectivului material nu este permisă de reglementările legale sau depăşeşte aria de utilizare permisă, va trebui obţinută permisiunea de utilizare direct de la deţinătorul licenţei. O copie a acestei licenţe este disponibilă la adresa http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.