Prevalenţa mutaţiilor 35delG şi W24X la copiii cu hipoacuzie congenitală non-sindromică

Introducere

Conform datelor raportate de Organizaţia Mondială a Sănătăţii, actualmente în populaţia globului se înregistrează peste 250 de milioane de persoane ce suferă de afecţiuni ale auzului de diverse etiologii, ceea ce reprezintă 4,2% din populaţia globului^(4,5,19,21). Hipoacuzia congenitală este o afecţiune relativ frecventă, cu o incidenţă ce variază conform diverselor surse din literatură de la 1-3/1000 nou-născuţi⁽²⁶⁾ la 1/500 nou-născuţi⁽³³⁾. Deşi heterogene din punct de vedere etiologic, cel puţin 50% din hipoacuziile cu debut precoce au cauze genetice, iar dintre acestea, majoritatea sunt cel mai probabil autozomal recesive (75-80%)⁽³³⁾ şi non-sindromice (70%)^{(26,33,13,24)}. Din cauza heterogenităţii etiologice a hipoacuziei, evaluarea şi sfatul genetic ridică probleme, în special în cazul copiilor cu vârste foarte mici. Cu toate acestea, descoperirile recente indică mutaţiile genelor GJB2 şi GJB6 de pe cromozomul 13q11-q12 drept responsabile de peste 50% din formele de hipoacuzie congenitală non-sindromică autozomal recesivă în anumite grupuri populaţionale. Acest fapt uşurează în mare măsură diagnosticul genetic şi oferă familiilor şanse sporite de a obţine informaţii cu privire la o astfel de afectare genetică. 

Genele GJB2 şi GJB6 codează proteinele membranare Connexina 26 (Cx26) şi Connexina 30 (Cx30) ce alcătuiesc canalele intercelulare heteromerice numite gap-junction, structuri cu rol în homeostazia cohleară, ce asigură fluxul de ioni de K⁺ de la celulele ciliate interne şi externe la celulele de susţinere, apoi la fibrocitele ligamentului spiral şi ale limbului spiral şi înapoi în endolimfă. Lista de variante allelice pentru GJB2 cuprinde peste 100, în special pentru formele autozomal recesive. Deleţia unei singure guanine (35delG) este responsabilă pentru 50% din cazurile de hipoacuzie neurosenzorială non-sindromică în populaţia Europei, Americii de Nord şi Asiei^(22,25,38). Deleţia comună 342-Kb a GJB6 (numită GJB6-D13S1830) apare la până în 20% din hipoacuzicii din S.U.A. şi poate fi responsabilă de aproximativ 10% din toate allelele DFNB1, având o rază de acţiune foarte largă, bazată pe originea etnică şi adesea în asociere digenică cu varianta 35delG/GJB2^(11,14,25).

Studii foarte recente au formulat şi o altă ipoteză conform căreia mutaţiile genei GJB6 nu ar avea nici o contribuţie în apariţia hipoacuziei şi că proteina Connexina 30 nu ar face decât să moduleze acţiunea Connexinei 26, iar hipoacuzia legată de cele trei mutaţii dominante cunoscute ale GJB6 ar reflecta alterări funcţionale ale canalelor heteromerice ce conţin Cx26 normală şi Cx30 modificată. Astfel, la pacienţii surzi care prezintă o deleţie a GJB6, cauza hipoacuziei ar fi un defect al Connexinei 26 modulat de mutaţia genei GJB6⁽⁶⁾.

O afectare genetică aduce după sine şi consecinţe sociale şi psihologice asupra familiei (grija pentru starea de sănătate a copilului, sentimentul de stigmatizare, sentimentul de vinovăţie cu privire la transmiterea unei atare afecţiuni către copil) care pot afecta capacitatea părinţilor de a se adapta situaţiei⁽¹⁷⁾. După naşterea unui copil surd, părinţii nu cunosc de obicei etiologia  afecţiunii iar majoritatea nu se aşteaptă la o cauză genetică, în special când nu există un istoric familial sugestiv⁽³⁴⁾.

Material şi metodă

Studiul a fost efectuat pe un lot de 30 de copii (18 fete şi 12 băieţi) cu vârste cuprinse între 2 şi 10 ani (vârsta medie: 4,62 ani), proveniţi din 29 de familii fără grad de rudenie între ele, diagnosticaţi cu hipoacuzie severă sau profundă bilaterală congenitală în cadrul Secţiei O.R.L. a Spitalului Clinic de Urgenţă pentru copii „Marie Sklodowska Curie” în perioada octombrie 2014 - aprilie 2015. După elucidarea istoricului familial şi personal al pacientului, bazat pe un interviu personalizat, s-a efectuat examenul clinic O.R.L. complet. Acesta a avut drept scop excluderea formelor sindromice de hipoacuzie congenitală sau a altor patologii asociate. Interviul personalizat a avut drept scop obţinerea de informaţii esenţiale cu privire la istoricul sarcinii (starea de sănătate a mamei, expunerea la poluanţi, utilizarea de medicamente, în special ototoxice), al naşterii (prematuritatea, hipoaxia, hiperbilirubinemia, traumatismele craniene, perioada petrecută în secţia de Terapie Intensivă Neonatală etc.) şi evoluţia hipoacuziei (vârsta la care a fost observată).

Diagnosticul audiologic a fost stabilit în funcţie de vârsta copilului (după excluderea unei patologii de ureche medie), fie pe baza testării prin otoemisiuni acustice (OAE) şi potenţiale evocate de trunchi cerebral (BERA şi ASSR) pentru copiii cu vârsta sub 4 ani (cu respectarea normelor impuse de ghidurile internaţionale în vigoare)⁽²⁾, fie prin audiogramă tonală liminară pentru copiii cu vârsta peste 4 ani. Cazurile de hipoacuzie dobândită sau formele sindromice de hipoacuzie congenitală nu au fost incluse în studiu. În studiu nu au fost incluşi pacienţi cu istoric familial sugestiv pentru hipoacuzie dar au fost păstraţi pacienţii ce prezentau în antecedente factori de risc pentru apariţia hipoacuziei congenitale (tratamente ototoxice, hipoxia la naştere, prematuritatea etc.) deoarece s-a constatat că prezenţa acestor factori nu exclude automat prezenţa mutaţiilor genetice. Pacienţii incluşi în studiu nu au beneficiat de screening auditiv neo-natal chiar dacă unii dintre ei aveau factori de risc cerţi pentru apariţia hipoacuziei. Vârsta medie de diagnosticare a hipoacuziei a fost de 2,7 ani.

După obţinerea consimţământului informat al părinţilor s-au prelevat probe de sânge periferic pentru efectuarea de teste moleculare şi stabilirea unei posibile cauze genetice a hipoacuziei. Prelevarea s-a efectuat în eprubete cu EDTA. ADN-ul a fost extras din sângele periferic prin cultivarea in vitro a limfocitelor. Culturile au fost oprite în metafază cu colchicină. Analiza moleculară s-a realizat prin amplificarea directă a ADN-ului din genom folosind primeri specifici prin metoda PCR. Tehnicile folosite au fost AS-PCR şi multiplex PCR pentru analiza mutaţiilor 35delG şi W24X ale genei GJB2.

Rezultate

Întrucât testarea genetică este o analiză costisitoare iar mijloacele financiare alocate studiului  limitate, s-a efectuat o selecţie a pacienţilor. Iniţial am evaluat un lot extins de 52 de pacienţi copii, cu hipoacuzie neuro-senzorială severă sau profundă bilaterală. Au fost selectaţi 30 dintre aceştia (57% din cazuri), copii care nu asociau alte probleme de sănătate (forme non-sindromice) şi care proveneau din părinţi cu auz normal. Aceşti 30 de subiecţi au fost supuşi unui screening molecular pentru determinarea mutaţiilor 35delG şi W24X ale genei GJB2.

Pentru mutaţia 35delG, 26,6% din pacienţi (8/30) se încadrează în grupul homozigot, cunoscut drept genotip Δ/Δ (litera Δ care precede numele unei gene semnifică faptul că acea genă prezintă o deleţie cromozonială, iar litera N reprezintă lipsa deleţiei), iar 6,66% din pacienţi (2/30) aparţin grupului heterozigot digenic 35delG/W24X. Nu a fost descoperit nici un caz de pacient ce aparţine grupului heterozigot, genotip Δ/N. Mutaţia unică W24X s-a regăsit sub formă homozigotă la 6,66% din pacienţi (2/30) şi în formă heterozigotă la 3,33% din pacienţi (1/30). Rezultatele sunt prezentate în tabelul 1.
 

Incidenţa de apariţie a allelei mutante 35delG în lotul de studiat a fost de 33%, în concordanţă cu studiile publicate anterior în literatura, iar a allelei W24X de 16% (tabelul 3).
 

Discuţii

Hipoacuzia neuro-senzorială reprezintă una dintre cele mai frecvent întâlnite dizabilităţi ale omului iar factorul genetic joacă un rol principal în cercetarea şi diagnosticul acesteia. Până în prezent au fost identificaţi peste 130 de loci ai hipoacuziei non-sindromice la om şi se estimează că peste 100 de mutaţii ale genelor connexinei 26 ar fi implicate⁽¹⁾. Diagnosticul genetic al hipoacuziei neuro-senzoriale congenitale non-sindromice este deosebit de dificil din cauza varietăţii de mutaţii descrise drept răspunzătoare de apariţia ei. Ca factor adiţional, predominanţa unei anumite gene implicate variază semnificativ cu tipul de populaţie.

Mutaţia 35delG a genei GJB2 rămâne principala cauză de apariţie a surdităţii cu substrat genetic în populaţia de tip caucazian, cu o incidenţă a purtătorilor care variază de la 1/35 în populaţia sud-europeană la 1/79 la cea nord-europeană^(10,12) şi o incidenţă maximă în ţările din jurul Mediteranei^(1,8,18). Mutaţia 35delG este, de asemenea, una dintre cele mai frecvente mutaţii cu potenţial patogen la om, cu o frecvenţă a purtătorilor asemănătoare cu mutaţia deltaF508 a fibrozei chistice (CFTR)^(10,37). Ea poate fi regăsită atât ca homozigot cât şi ca heterozigot. De asemenea, se poate asocia cu alte mutaţii ale genei GJB2 dar şi cu mutaţii ale genei GJB6 precum D13S1830 care este a doua mutaţie ca frecvenţă în apariţia hipoacuziei non-sindromice în populaţia europeană. La anumite grupuri populaţionale precum japonezii, chinezii, evreii aşkenazi sau populaţiile de origine rromă, mutaţia 35delG este rară, locul ei în cadrul etiologiei genetice a hipoacuziei congenitale fiind preluat de alte mutaţii precum 235delC, 167delT sau W24X⁽¹⁵⁾.

Studiul de faţă evidenţiază incidenţa de apariţie a mutaţiei 35delG şi secundar a mutaţiei W24X în populaţia afectată de hipoacuzie congenitală. Cu toate că s-a limitat la cazurile prezentate într-o singură clinică şi la un număr relativ mic de probe prelevate, studiul a relevat că screening-ul a două etiologii comune precum mutaţiile 35delG şi W24X şi selecţia riguroasă a cazurilor, pot evidenţia prezenţa factorului genetic la aproape 50% dintre pacienţii cu hipoacuzie neuro-senzorială congenitală severă sau profundă bilaterală de cauză necunoscută. Incidenţa 35delG a fost de 26,6%, în concordanţă cu studii asemănătoare ce raportează, în funcţie de populaţia studiată, 13,6% în Iordania, 14% în Palestina^(1,32) 16% în Egipt^(1,23) 5,66% în Iran^(1,22) 94% în Liban^(1,16) şi 60-80% în populaţiile europene^(1,35) (tabelul 2) în vreme ce frecvenţa relativă a tuturor allelelor mutante 35delG a fost de 33%, de asemenea în în concordanţă cu studiile publicate anterior în literatura (tabelul 3). Cercetările efectuate în Orientul Mijlociu au determinat şi faptul că prezenţa crescută a mutaţiilor 35delG este în strînsă legătură cu nivelul crescut de consangvinitate în cadrul populaţiilor respective, lucru ce nu se aplică în cazul populaţiilor europeane, respectiv românească.
 

În cadrul studiilor efectuate până în prezent, frecvenţa purtătorilor de mutaţie 35delG variază de la 1,1% în Iordania la 1,66% în Siria şi la 3,2 în Italia, cea mai mare frecvenţă cunoscută până în acest moment⁽¹⁾.

Rezultatele studiului de faţă sugerează faptul că prevalenţa crescută a mutaţiei 35delG în populaţia românească ar reprezenta premizele pentru instituirea diagnosticului şi sfatului genetic la un nivel extins, dar şi importanţa continuării investigaţiilor pe această temă. Tehnica utilizată în detecţia mutaţiilor este în continuare destul de laborioasă şi scumpă, iar uneori predispusă la erori de secvenţiere⁽¹⁰⁾.

W24X este altă allelă relativ frecvent întâlnită în etiologia hipoacuziei neurosenzoriale non-sindromice, în special în populaţiile din nordul şi sudul Indiei^(1,20,30). Această mutaţie a fost descoperită în studiul nostru cu o incidenţă de 10% homozigot şi 6,66% heterozigot digenic.

Diagnosticarea unui copil cu hipoacuzie include o întreagă baterie de teste pentru stabilirea etiologiei^(9,26), dar în absenţa indiciilor pentru o suferinţă sindromică, testarea genei GJB2 este actualmente recomandată drept test iniţial^(2,26) urmată de testarea pentru deleţia GJB6 în cazul unui test negativ^(26,27). Aceste teste genetice au devenit o modalitatea foarte utilă de diagnosticare pentru specialistul O.R.L. în tentativa de a explica etiologia hipoacuziei depistate prin screening auditiv post-natal. Beneficiul principal al testării GJB2/GJB6 este faptul că, în anumite cazuri, poate explica apariţia hipoacuziei fără a mai fi necesare teste suplimetare^(26,31), dar poate, de asemenea, aduce informaţii despre modul de transmitere al mutaţiei sau şansele de apariţie şi la posibilii urmaşi^(26,31,36).

Cu toate că diagnosticul genetic este deosebit de costisitor şi nu este efectuat frecvent în ţările în curs de dezvoltare, investigarea mutaţiilor genei GJB2 devine esenţială pentru clarificarea problemei hipoacuziei congenitale. Acest diagnostic conduce la efectuarea sfatului genetic pentru membrii familiei şi facilitează reabilitarea precoce a copilului.

Concluzii

Studiul de faţă confirmă prezenţa într-un procent relativ mare a mutaţiei 35delG a genei GJB2 în cazurile de hipoacuzie neuro-senzorială congenitală non-sindromică profundă bilaterală, fapt ce este în concordanţă cu cifrele raportate în literatură. La doi pacienţi a fost descoperită o dublă mutaţie 35delG/W24X. Aceste rezultate subliniază importanţa diagnosticului genetic în clarificarea etiologiei şi în implementarea cât mai precoce a unui program de recuperare auditiv-lingvistică a pacientului. De asemenea, prin frecvenţa crescută a purtătorilor în populaţiile europene, se prefigurează necesitatea pentru screening-ul mutaţiei 35delG lucru ce ar facilita identificarea precoce a acestor purtători şi consilierea familială necesară în aceste cazuri.  

Acknowledgments: Această lucrare a beneficiat de suport financiar prin proiectul „CERO - Cercetător roman de carieră”, POSDRU/159/1.5/S/135760 cofinanţat de Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013./This work received financial support through the project entitled “CERO- Career profile: Romanian Researcher”, grant number POSDRU/159/1.5/S/135760 cofinanced by the European Social Fund for Sectoral Operational Programme Human Resources Development 2007-2013”.