TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Implementarea unui protocol de tip Real‑Time PCR HRM pentru diagnosticul mielopatiei degenerative la câine

 Development of a Real‑Time PCR HRM protocol for canine degenerative myelopathy diagnosis

First published: 23 septembrie 2022

Editorial Group: MEDICHUB MEDIA

DOI: 10.26416/PV.37.3.2022.7006

Abstract

Genetic disorders in small animals represent a well investigated area, with numerous genetic events being described along with their specific mechanism. However, for many of those, the diagnostic workflow tends to be tedious and prohibitive from the cost perspective, with costly instruments and reagents. Luckily, there are situations where the diagnosis involves the detection of relatively easy to reveal genetic events, such as point mutations or small indels. The present paper describes the implementation of a Real-Time PCR High-Resolution Melting HRM protocol for canine degenerative myelopathy diagnostic, with numerous advantages regarding sensitivity and robustness as well as ease of use.

Keywords
dog, degenerative myelopathy, Real‑Time PCR HRM

Rezumat

Maladiile cu etiologie genetică la animalele de companie reprezintă un domeniu destul de bine investigat, fiind descrise numeroase afecţiuni cu determinism genetic şi mecanismele de acţiune specifice. Totuşi, pentru multe dintre acestea, metodologia de diagnostic este una extrem de laborioasă şi nu de puţine ori prohibitivă din punct de vedere financiar, fiind necesare dotări costisitoare şi utilizarea unor reactivi cu un cost apreciabil. Din fericire însă, există situaţii în care diagnosticul necesită evidenţierea la nivel genetic a unor evenimente relativ facile, cum ar fi mutaţii punctiforme, inserţii/deleţii de dimensiuni reduse etc. Această lucrare descrie implementarea unui protocol de tip Real‑Time PCR cuplat cu analiza curbelor de topire de înaltă rezoluţie (HRM) pentru diagnosticul mielopatiei degenerative, cu avantaje atât în ceea ce priveşte sensibilitatea şi robusteţea, cât şi uşurinţa în utilizare.

Introducere

Scleroza amiotrofică laterală (ALS – Amyotrophic lateral sclerosis) la om este definită ca fiind un grup eterogen de boli care apar la indivizii adulţi, având ca rezultat fenomene neurodegenerative cu un caracter progresiv, cu exprimare clinică stadială plecând de la slăbirea forţei musculare până la fenomene de paralizie cu diferite grade de severitate şi, în ultim stadiu, moarte. Epidemiologic, 5% până la 10% dintre cazurile de ALS sunt de tip familial, iar dintre acestea aproximativ 20% au drept cauză mutaţii la nivelul genei SOD1 (superoxid dismutaza 1)(2,6,7).

Relativ recent(1), o mutaţie similară a fost descrisă şi la unele rase de câini şi tot la nivelul genei SOD1, responsabilă de demielinizarea axonilor şi, consecutiv, de fenomene clinice anterior amintite. Mai exact, este vorba despre o boală autozomală recesivă cu penetrabilitate incompletă, cauzată de tranziţia (c.118G>A) la nivel de exon 2 şi, consecutiv, înlocuirea glutamatului cu lizină în poziţia 40 a lanţului polipeptidic(1,3).

Până în prezent, numeroase tehnici au fost descrise pentru diagnosticul mutaţiei genei SOD1 la câine, plecând de la standardul de aur în biologia moleculară – secvenţiere(1) până la tehnici de tipul PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)(3), pirosecvenţiere, Real‑Time PCR utilizând sonde de tip MGB (minor groove binding)(4,5). Conform autorilor, fiecare dintre aceste tehnici este capabilă să identifice evenimentul genetic cauzal, totuşi în practică există unele limitări legate de implementarea unui astfel de test, fiind necesar un laborator de specialitate echipat cu aparatură performantă şi costisitoare (secvenţiere ADN), flux de lucru laborios şi costisitor (PCR-RFLP) sau accesibilitatea şi costul unor reagenţi (Real‑Time PCR cu sonde MGB).

În lucrarea de faţă este descris un flux de lucru capabil să contracareze majoritatea neajunsurilor anterior amintite, fiind utilizată o tehnică ce are un cost redus comparativ cu celelalte (Real‑Time PCR HRM), amplificarea şi detecţia fiind efectuate într-un singur tub de reacţie şi care nu necesită postprocesare.

Extracţia ADN‑ului genomic

Extracţia ADN‑ului genomic a fost efectuată din mai multe categorii de probe biologice, fiind prelevate tampoane gingivale, sânge integral recoltat pe EDTA şi tampoane rectale. Indiferent de tipul de matrice biologică, a fost utilizat un kit comercial dedicat (QIAamp DNA Mini Kit – Qiagen, Hilden, Germania), conform protocolului recomandat de producător, cu mici modificări în ceea ce priveşte volumele reagenţilor şi numărul etapelor de spălare coloniţe de purificare (modificări disponibile la cerere), cu eluţia ADN într‑un volum final de 150 µl.

Amplificarea regiunii genice de interes

Etapa de amplificare a presupus utilizarea de primeri specifici care să amplifice un fragment de 56 de nucleotide (M.A. Turcitu, nepublicat) utilizând kitul specific (Type-it HRM PCR Kit – Qiagen, Hilden, Germania) şi aparatul RotorGene Q model 5plex HRM (Qiagen, Hilden, Germania). Fluorescenţa a fost colectată la finalul fiecărui ciclu, cu generarea curbelor de amplificare de către aparat (figura 1).
 

Figura 1. Curbele de amplificare obţinute în urma etapei PCR. Se remarcă obţinerea unor valori Ct (crossing treshold) similare indiferent de matricea biologică analizată
Figura 1. Curbele de amplificare obţinute în urma etapei PCR. Se remarcă obţinerea unor valori Ct (crossing treshold) similare indiferent de matricea biologică analizată

Etapa HRM

Ulterior etapei de amplificare Real‑Time PCR, probele au fost supuse analizei HRM cu următorul profil termic: creşterea progresivă a temperaturii de la 75°C la 85°C cu un increment de 0,1°C şi colectarea continuă a fluorescenţei. Consecutiv acestei etape, au fost obţinute curbele de topire specifice (figura 2).
 

Figura 2. Curbele de topire obţinute consecutiv analizei HRM. Se remarcă un comportament termodinamic diferit al probelor în funcţie de genotip – homozigot sălbatic (verde) cu o temperatură de topire mai mare, homozigot mutant (roşu) cu o temperatură de topire mai mică, heterozigot (albastru) cu o curbă de topire în două etape (inflexiunea iniţială a curbei)
Figura 2. Curbele de topire obţinute consecutiv analizei HRM. Se remarcă un comportament termodinamic diferit al probelor în funcţie de genotip – homozigot sălbatic (verde) cu o temperatură de topire mai mare, homozigot mutant (roşu) cu o temperatură de topire mai mică, heterozigot (albastru) cu o curbă de topire în două etape (inflexiunea iniţială a curbei)

După terminarea experimentului, cu ajutorul softului dedicat au fost obţinute genotipurile aşteptate prin utilizarea algoritmilor specifici (figura 3).
 

Figura 3. Peakurile obţinute prin interpretarea rezultatelor. Se poate observa o temperatură de topire mai mare pentru indivizii homozigoţi pe alela sălbatică (verde), comparativ cu cei homozigoţi pe alela mutantă (roşu). Pentru indivizii heterozigoţi (albastru), se observă un peak suplimentar de dimensiuni reduse
Figura 3. Peakurile obţinute prin interpretarea rezultatelor. Se poate observa o temperatură de topire mai mare pentru indivizii homozigoţi pe alela sălbatică (verde), comparativ cu cei homozigoţi pe alela mutantă (roşu). Pentru indivizii heterozigoţi (albastru), se observă un peak suplimentar de dimensiuni reduse

Validarea rezultatelor

Aceasta a fost efectuată prin analiza unor pacienţi analizaţi anterior pentru mutaţia SOD1 de către un laborator acreditat ISAG (International Society of Animal Genetics), din rasa Ciobănesc Australian, prin analiza comparativă a unui număr de 27 de indivizi din toate cele trei categorii posibile (opt indivizi homozigoţi sălbatic, nouă heterozigoţi, zece homozigoţi mutant). Rezultatele obţinute au avut o concordanţă de 100%.  

Bibliografie

  1. Awano T, Johnson GS, Wade CM, Katz ML, Johnson GC, Taylor JF, et al. Genome-wide association analysis reveals a SOD1 mutation in canine degenerative myelopathy that resembles amyotrophic lateral sclerosis. PNAS. 2009;106: 2794–2799. pmid:19188595.

  2. Boillee S, Velde CV, Cleveland DW. ALS: A disease of motor neurons and their nonneuronal neighbors. Neuron. 2006;52:39–59.

  3. Santos CRO, Gouveia JJS, Gouveia GV, Bezerra FCM, Nogueira JF, Baraúna Júnior D. Molecular screening for the mutation associated with canine degenerative myelopathy (SOD1:c.118G > A) in German Shepherd dogs in Brazil. PLoS One. 2020 Nov 16;15(11):e0242347.

  4. Chang HS, Kamishina H, Mizukami K, Momoi Y, Katayama M, Rahman MM, Uddin MM, Yabuki A, Kohyama M, Yamato O. Genotyping assays for the canine degenerative myelopathy-associated c.118G>A (p.E40K) mutation of the SOD1 gene using conventional and real-time PCR methods: a high prevalence in the Pembroke Welsh Corgi breed in Japan. J Vet Med Sci. 2013;75(6):795-8.

  5. Capucchio MT, Spalenza V, Biasibetti E, Bottero MT, Rasero R, Dalmasso A, Sacchi P. Degenerative myelopathy in German Shepherd Dog: comparison of two molecular assays for the identification of the SOD1:c.118G>A mutation. Mol Biol Rep. 2014 Feb;41(2):665-70.

  6. Rosen DR, Siddique T, Patterson D, Figlewicz DA, Sapp P, Hentati A, Donaldson D, Goto J, O’Regan JP, Deng HX, et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 1993 Mar 4;362(6415):59-62.

  7. Schymick JC, Talbot K, Traynor BJ. Genetics of sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Hum Mol Genet. 2007 Oct 15;16 Spec No. 2:R233-42. 

Articole din ediţiile anterioare

PARAZITOLOGIE | Ediţia 2 31 / 2018

Oncocercoza oculară canină

Poliana Tudor

Oncocercoza oculară canină este o nematodoză produsă de Onchocerca lupi, un nematod filaroid care se localizează în ţesutul conjunctival al sclerei...

28 iunie 2018
MEDICINĂ INTERNĂ | Ediţia 1 35 / 2022

Osteodistrofia hipertrofică la câine – aspecte clinice şi radiografice

Niculae Tudor

Osteodistrofia hipertrofică, sau osteopatia metafizară, este o afecţiune osoasă întâlnită la tineretul canin în perioada de creştere. Tabloul clini...

29 martie 2022
NEUROLOGIE | Ediţia 4 33 / 2018

Diagnosticul şi managementul bolilor neuromusculare

Mihai Musteață

Bolile manifestate prin tetrapareză acută flască reprezintă un procent redus din grupul pacienţilor neurologici. Cele mai frecvente prezentări clin...

18 decembrie 2018
BOLI INTERNE | Ediţia 3 28 / 2017

Importanţa clinică și diagnostică a nivelului seric al fructozaminei în diabetul zaharat la câine și pisică

Mario Codreanu, Alexandra Mihaela Popa

Fructozamina este o proteină utilizată în monitorizarea şi controlul diabetului zaharat. Concentrația fructozaminei nu este afectată de stres, fiin...

14 septembrie 2017